紫外－可见分光光度法测定袋装口含烟溶入人工唾液中的烟碱含量

袁大林，杨 继，汤建国，杨 柳，吴 俊，段沅杏，巩效伟，陈永宽

（云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明650231）

紫外－可见分光光度法测定袋装口含烟溶入人工唾液中的烟碱含量

袁大林，杨 继，汤建国，杨 柳，吴 俊，段沅杏，巩效伟，陈永宽＊

（云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明650231）

袋装口含烟样品经自行设计的溶出装置使其中的烟碱溶入于人工唾液中，从所收集的人工唾液中分取试液1.00mL，加入pH 4.6的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲溶液1.0mL和饱和甲基橙溶液1.0mL，混匀，生成黄色络合物。加入二氯甲烷4.0mL，涡旋1min，静置15min，取下层萃取液，于波长420nm处测量其吸光度。烟碱的质量浓度在1.00～150mg·L－1范围内与吸光度呈线性关系，检出限（3s）为0.08mg·L－1。按标准加入法进行回收试验，回收率在97.3%～103%之间，测定值的相对标准偏差（n＝6）在0.86%～1.2%之间。

紫外－可见分光光度法；烟碱；袋装口含烟；人工唾液

无烟气烟草（简称ST）制品是指不经燃烧过程，直接通过口腔或鼻腔吸食的烟草制品［1］。与传统卷烟相比主要具有以下优点：一是使用时不经燃烧，降低了因燃烧而产生的焦油和其他有害成分，相比之下危害性较小［2－5］；二是不产生二手烟气，不影响公共场所的空气质量，并能在一定程度上缓解公共场所禁烟和吸烟的矛盾；三是不受场所限制，且能在一定程度上满足烟民的生理需要［6］。袋装口含烟属于无烟气烟草制品，是将粉碎到一定粒径的烟草经过加工处理后包于小袋的烟草制品，使用时直接将其置于口腔内，无需咀嚼，其主要成分经唾液溶解后经口腔黏膜吸收［7］。随着世界各地禁烟力度不断加大，一些国家限制吸烟，并定制实施十分严格的公共场所禁烟令，口含型无烟气烟草受到较高重视，国内相关部门也已开展对袋装口含烟的研究［8］。

烟碱是烟草众多成分中较重要的一种生物碱，其含量及释放速率是评价各种口含型无烟气烟草制品品质的重要指标，同时也是制作袋装口含烟的一项重要参数。现有测定烟碱的分析方法有气相色谱法［910］、高效液相色谱法［11］、紫外分光光度法［12］、非水滴定法、旋光法和钨酸重量法［13］等。气相色谱法前处理过程复杂，分析时间长（一个样需20～30min）；而用高效液相色谱法测定时，以人工唾液为基质的袋装口含烟释放液成分复杂，离子含量过高，会导致柱压升高，缩短泵使用寿命等不良后果。依据烟碱在一定条件下能与甲基橙发生络合反应，生成的黄色络合物在可见光区的吸光度与烟碱含量成正比这一原理，本工作采用紫外－可见分光光度法快速测定袋装口含烟释放液中烟碱的含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Crystal HYQ－2110型涡旋混匀器；S 20型酸度计；XP 504型分析天平（感量0.000 1g）；BT 100N型蠕动泵；TU－1901型紫外－可见分光光度计。

氯化钠溶液：10.00mmol·L－1。

磷酸二氢钾溶液：2.50mmol·L－1。

柠檬酸溶液：0.15mmol·L－1。

碳酸氢钾溶液：15.00mmol·L－1。

氯化镁溶液：1.50mmol·L－1。

氯化钙溶液：1.50mmol·L－1。

人臣为“男为人臣”之“人臣”，谓奴隶。隶圉，亦奴隶，隶服杂役，圉养马。襄公二十三年《传》“斐豹，隶也，谓宣子曰：‘苟焚丹书，我杀督戎。’”免即焚丹书，使为自由民。[8](P1614)

磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲溶液：由0.2mol· L－1磷酸氢二钠溶液4mL和0.1mol·L－1柠檬酸溶液16mL混合配制而成。

烟碱标准储备溶液：1.00g·L－1，称取烟碱标准品0.100 0g置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容。

人工唾液：称取10.00mmol·L－1氯化钠溶液0.585 0g、2.40mmol·L－1磷酸氢二钠溶液0.340 8g、2.50mmol·L－1磷酸二氢钾溶液0.340 0g、0.15mmol·L－1柠檬酸溶液0.028 8g、15.00mmol·L－1碳酸氢钾溶液1.501 8g、1.50mmol·L－1氯化镁溶液0.142 5g和1.50mmol·L－1氯化钙溶液0.166 5g，加水1L溶解，并用12.5mol·L－1盐酸溶液调节pH至6.7。

烟碱标准品（纯度大于98.5%），其他试剂均为分析纯，试验用水为超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 烟碱的溶出和收集

袋装口含烟中烟碱等的溶出和收集装置见图1，主要包括唾液储存瓶、恒流泵、溶出池、袋装口含烟、收集管和支架等6个组件。将人工唾液加到溶媒存储瓶中，设定恒温槽温度为37℃的人体温度，人工唾液以流量2mL·min－1经恒流泵至溶出池淋洗袋装口含烟，口含烟中各种组分在溶出池内溶出，通过流量控制器实现新鲜介质即人工唾液不断流入，释放液不断流出，模拟无烟气烟草制品主要成分在口腔中的溶出－吸收的过程。流经样品的释放液通过玻璃套管内腔底部出口收集到收集瓶中，每1min收集一次，共收集15min，用人工唾液定容至50.0mL。

图1 袋装口含烟中烟碱的溶出和收集装置Fig.1 Installation for dissoiution and collection of nicotine from BST

1.2.2 吸光度的测定

从收集的人工唾液中移取样液1.00mL，加入pH 4.6的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲溶液1.0mL，饱和甲基橙溶液1.0mL，摇匀，加入二氯甲烷4.0mL，涡旋1min后静置15min，取下层萃取液，立即在分光光度计上于420nm处测量吸光度（A）。

2 结果与讨论

2.1 试验条件的选择

2.1.1 萃取剂

移取不同烟碱质量浓度的样品溶液各1.00mL，加入磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲溶液1.0mL（pH分别为3.0，3.6，4.2，4.6，5.0，5.4，5.8）和饱和甲基橙溶液1.0mL，摇匀，再加入4.0mL 萃取剂（二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷）涡旋1min，静置，取有机层用紫外－可见分光光度法测量吸光度，结果见图。

图2 在不同烟碱质量浓度和不同酸度条件下不同萃取溶剂的影响Fig.2 Effect of various extraction solvents under various mass concentrations of nicotine and various acidity

由图2可知：对于相同质量浓度的样品在相同酸度条件下，二氯甲烷的萃取效果比三氯甲烷好，可能是因为三氯甲烷密度较大，涡旋时混匀效果不好。而正己烷极性太小，对烟碱－甲基橙络合物萃取效果较差。试验选择二氯甲烷为萃取剂。

2.1.2 缓冲溶液的酸度

试验考察了磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲溶液的pH分别为3.0，3.6，4.2，4.6，5.0，5.4，5.8，6.4时对络合物吸光度的影响，结果见图3。

图3 缓冲溶液酸度对络合物吸光度的影响Fig.3 Effect of acidity of butter solution on absorbance of the complex

由图3可知：对于相同质量浓度的样品，烟碱甲基橙络合物在pH 4.6的缓冲溶液中吸光度最大。试验选择磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲溶液的pH为4.6。

2.1.3 甲基橙的用量

试验考察了饱和甲基橙溶液的用量分别为0.5， 1.0，1.5，2.0mL时对络合物吸光度的影响，结果表明：当饱和甲基橙溶液用量为1.0mL时，络合物的吸光度达到最大。试验选择饱和甲基橙溶液的用量为1.0mL。

2.1.4 二氯甲烷的用量

试验考察了萃取剂二氯甲烷的用量分别为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL时对络合物萃取的影响，结果见图4。

图4 二氯甲烷用量对络合物萃取的影响Fig.4 Effect of amounts of CH2Cl2on extraction of the complex

由图4可知：相同质量浓度的样品的吸光度随萃取剂二氯甲烷用量的增加而减小。含量较高的样品中加入2.0mL或3.0mL二氯甲烷后，萃取液中烟碱含量较高，吸光度过大，对仪器造成过载。而含量较低的样品中加入5.0mL或6.0mL二氯甲烷后，萃取液中烟碱含量较低，吸光度过小，影响测定。故试验选择萃取剂二氯甲烷的用量为4.0mL。

2.1.5 涡旋后静置时间

按试验方法制备3个样品萃取液，分别涡旋后静置1，5，10，15，20，30，60min，然后取有机相测量吸光度。试验结果表明：若静置时间较短，萃取不完全，测定值不稳定；涡旋静置15min后测定值趋于稳定。试验选择涡旋后静置15min。

2.2 标准曲线和检出限

分别移取烟碱标准储备溶液0.05，0.25，0.50，2.50，5.00，7.50mL置于50mL棕色容量瓶中，用人工唾液定容，配制成1.00，5.00，10.0，50.0，100，150mg·L－1烟碱标准溶液，按试验方法测定。以烟碱的质量浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。烟碱的质量浓度在1.00～150mg·L－1之间与吸光度呈线性关系，其线性回归方程为y＝0.200 8 x＋0.150 2，相关系数为0.999 8。采用低质量浓度标准溶液重复进样10次，以测定结果的3倍标准偏差为检出限，方法的检出限（3s）为0.08mg·L－1。

2.3 精密度与回收试验

按试验方法制备样品萃取液，取其中3份释放液分别平行测定6次，计算测定值的相对标准偏差（RSD），并对样品进行加标回收试验，结果见表1。

表1 精密度和回收试验结果（n＝6）Tab.1 Results of tests for precision and recovery

由表1可知：样品溶液中烟碱的加标回收率在97.3%～103%之间，说明该方法可用于口含烟释放液中烟碱含量的测定。

本工作建立了紫外－可见分光光度法快速测定袋装口含烟体外释放液中烟碱的含量。该方法具有较宽的线性范围，较好的重复性以及较高的准确度，且前处理简便快捷，所使用设备简易，可为更好地探索袋装口含烟中烟碱的释放规律提供方便。

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［13］ 闫克玉.烟草化学［M］.郑州：郑州大学出版社，2002.

Determination of Nicotine in Simulated Saliva Dissolved from Bagged Smokeless Sucking Tobacco by UV－Vis Spectrophotometry

YUAN Da－lin，YANG Ji，TANG Jian－guo，YANG Liu，WU Jun，DUAN Yuan－xing，GONG Xiao－wei，CHEN Yong－kuan＊
（Technical Center of China Tobacco Yunnan Industrial Co.，Ltd.，Kunming650231，China）

By the self－made installation，the main constituents of the bagged smokeless sucking tobacco（BST），including nicotine were dissolved into simulated saliva，which was collected as described.An aliquot of 1.00mL was taken from it for analysis，and 1.0mL of citric acid－disodium hydrogen phospate buffer solution（pH 4.6）together with 1.0mL of saturated methyl orange solution was added and mixed thoroughly to form a yellow colored complex with nicotine.4.0mL of dichloromethane was added to the solution，and the mixture was swirled for 1min and stood for 15min to have the nicotine－methylorange complex transferred into the organic phase.The lower organic phase was separated and its absorbance was measured at the wavelength of 420nm.Linear relationship between values of absorbance and mass concentration of nicotine was found in the range of 1.00－150mg·L－1with detection limit（3s）of 0.08mg·L－1.Test for recovery was made by standard addition method，giving results in the range of 97.3%－103%，with RSDs（n＝6）in the range of 0.86%－1.2%.

UV－Vis spectrophotometry；Nicotine；Bagged smokeless sucking tobacco；Simulated saliva

O657.32

A

1001－4020（2017）04－0377－04

10.11973／lhjy－hx201704002

2016－03－23

中国烟草总公司科技重大专项［110201401017（XX－05）］；云南中烟工业公司科技开发计划（2015CP07）；袋装口含型无烟烟草制品研发（JSZX2014CP06）

袁大林（1979－），男，湖南新化人，工程师，主要从事烟草化学研究。

＊通信联系人。E－mail：cyk1966＠163.com