生物化学综合性实验的设计与实现
——以亲和层析法纯化猪胰蛋白酶为例

黄体冉， 刘悦萍， 张国庆， 王文平， 张 静

(1. 北京农学院 生物科学与工程学院, 北京 102206; 2. 农业部都市农业(北方)重点实验室, 北京 102206)

生物化学综合性实验的设计与实现
——以亲和层析法纯化猪胰蛋白酶为例

黄体冉1,2， 刘悦萍1， 张国庆1， 王文平1， 张 静1

(1. 北京农学院 生物科学与工程学院, 北京 102206; 2. 农业部都市农业(北方)重点实验室, 北京 102206)

生物化学实验是生命科学领域一门重要专业基础课，其所包含的实验技术在训练学生基本技能、培养实践能力和创新能力上起着至关重要的作用。围绕生物化学中蛋白质化学、酶学性质的有关内容，将鸡卵粘蛋白的制备、猪胰蛋白酶的制备、猪胰蛋白酶的纯化以及纯胰蛋白酶活性和鸡卵粘蛋白抑制活性的测定重新整合，设计了一个包括蛋白质分离纯化、蛋白质含量测定以及酶活性测定3个单元的综合性实验，并将光谱和色谱技术融入其中。最后对实验内容的综合性设计部分进行了探索性研究，以期为生物化学综合性、设计性实验开发和研究提供参考。

生物化学; 综合性实验; 柱层析; 分离纯化

0 引 言

生物化学实验是生命科学领域的一门专业基础课程之一，是植(动)物生理学、遗传学、细胞生物学、微生物学、分子生物学、细胞工程、基因工程等理论及其实验课程先修课程。在以往的生物化学实验教学中，基础性实验、验证性实验的授课学时占去了整个实验授课学时的大部分，学生只要按照实验指导书上的步骤按部就班的完成相关实验操作即可，一定程度上束缚了学生的思维，不利于学生主观能动性的发挥，更不利于学生分析和解决问题能力的培养和科学素养的形成[1]。综合性实验属于复合性实验范畴，往往与本课程综合知识相关的实验内容，或与本课程相关课程知识的实验，是综合训练学生技能的方法[2]。通过综合性实验教学，一方面使学生掌握的理论知识逐步系统化，激发学生带着好奇的眼光初步了解探索科学研究领域兴趣，培养和提高学生的动手能力；另一方面还可通过专业综合创新实验的训练，增加学生对科研领域中先进课题实验技能、原理、研究现状及发展前景的认知，提高学生关注和学习与学科前沿问题相关实验知识体系的意识，增强学生的科学探索与创新精神[3]。目前，国内多数实验指导教材，生物化学实验基本上是按照糖、脂肪、蛋白质、核酸等的理化性质为模块进行设置的，虽然每个模块单独设置实验，但实验项目之间衔接不够，甚至相互割裂，这在一定程度上制约了生物化学实验教学在培养应用型、创新型人才方面作用的发挥。近年来，生物化学教学团队结合自身教学实践，尝试将一些模块串联起来，形成一个内容相关、实验方法多样的综合性实验，同时对实验教学模式进行了改革，取得了良好的效果。

1 生物化学实验教学中存在的问题

教学实验是为达到某种教学目的而有计划安排的实验，是学生在实验室进行的教学活动[4]。生物化学课程教学的主要内容包括糖类、脂类、蛋白质(含氨基酸)、核酸(DNA和RNA)的理化性质、分离鉴定、定量测定，以及酶促动力学等内容[5]，相应地实验教学内容包括糖的颜色反应、可溶性总糖、还原糖和淀粉含量的测定、蛋白质理化性质及其定量测定、蛋白质的分离纯化、氨基酸含量测定、核酸定量测定、维生素C含量的测定、酶的特异性、温度、pH对酶活性的影响、酶活性的测定等。传统的生物化学实验教学一般是将这些单元作为一个独立实验进行教学。虽然开设的实验项目基本涵盖了主要教学内容，但实验内容简单，缺乏关联性、系统性。这种单元化教学方式很容易使得学生获得的知识也呈现单元化，进而导致学生不能很好理解生物化学的理论教学内容，更不能活学活用生物化学实验技术。如果能将这些单元化的实验串联起来，组装成一个综合性实验，必将有助于学生对生物化学实验的全局有一个把握，使学生能够深刻理解并掌握各实验间的有机联系。

2 综合性实验的内容与设计

普通高等学校开设综合性实验的目的，是通过课程实验，培养学生的实验综合与应用能力、理论与实际相结合的能力和创新研究能力[6]。因此，基于生物化学实验的特殊性，团队仅仅围绕上述目标，按照实验内容复合性、实验方法多元性、实验手段多样性、人才培养综合性的要求，秉承互补、交融、渗透、承前启后、递进的原则[4,6]，设计出了一个亲和层析法分离纯化猪胰蛋白酶的综合性实验。

2.1 综合性实验的内容

亲和层析法分离纯化猪胰蛋白酶的基本实验内容包括鸡卵粘蛋白的制备、猪胰蛋白酶的制备以及猪胰蛋白酶的纯化三部分内容。

2.1.1 鸡卵粘蛋白的制备

取新鲜鸡蛋蛋清50 mL，缓慢加入等体积10% pH 1.15 的三氯乙酸溶液，边加入边搅拌，直至蛋清沉淀均匀，用5 mol/L NaOH或5mol/L HCl调悬浊液的pH值至3.5，室温下静止4 h以上。 待清蛋白完全沉淀后，以3 000 r/min离心10 min，弃沉淀，上清液用滤纸过滤，除去上清液中的脂类物质及不溶物，收集滤液到500 mL烧杯，检查pH=3.5(准确)，放置冰浴冷却片刻，缓缓加入3倍体积的预冷丙酮，用玻璃棒搅拌均匀，并用塑料薄膜盖好防止丙酮挥发，冰浴放置4 h以上。待鸡卵粘蛋白完全沉淀后，小心倾出一部分上清液，剩余的部分沉淀液全部转移到50 mL离心管里，盖好盖，以3 000 r/min离心15 min，弃上清液，离心杯沉淀物放入真空干燥器或通风厨内抽气，除去残留丙酮，然后用20 mL蒸馏水溶解，如液体浑浊可用滤纸过滤，即可获得鸡卵粘蛋白粗品[7]。

取20 mL鸡卵粘蛋白粗品通过Sephadex G-25 柱层析脱盐(上样量不得超过柱床体积的1/6)用0.02 mol/L pH6.5磷酸缓冲液(以下简称Buffer)洗脱收集鸡卵粘蛋白粗提液；将脱盐的鸡卵粘蛋白粗提液上DE-32阴离子交换柱吸附， 以Buffer平衡，流出液经紫外分光光度计测定光吸收A280 nm小于0.02以后，改用含0.3 mol/L NaCl的Buffer洗脱，收集洗脱峰，收集体积一般在35-45 mL为宜。将经DEAE-32阴离子交换柱层析分离的鸡卵粘蛋白溶液装入透析袋内对蒸馏水透析，间隔一段时间更换一次蒸馏水，直到用1%AgNO3检查无氯离子为止；透析液转移到烧杯内，取出2 mL透析液测定鸡卵粘蛋白含量及其抑制活性，其余的透析液用1 mol/L HCl调到pH4.0，量取体积，然后加入3倍体积的预冷丙酮沉淀(此时应当出现大量的白色沉淀，否则就是溶液的pH值不准确)，盖上塑料膜，在冰浴里静置4 h以上或过夜；待鸡卵粘蛋白析出后，倾出部分上清液，剩余的沉淀液装入50 mL离心管里，于3 000 r/min离心15 min，弃去上清液，收集沉淀物真空干燥，干燥后的鸡卵粘蛋白为透明胶状物；然后以提取的鸡卵粘蛋白为样品，分别测定其浓度和活性[8]。

2.1.2 猪胰蛋白酶粗提取液的制备

称50 g猪胰脏(已剥去脂肪和结缔组织)，剪碎后装入组织捣碎机内，加入150 mL预冷的3.5%乙酸酸化水，匀浆(5 s/次，间隔30 s，共3次)，然后把匀浆转移到5 00 mL烧杯中，在4℃冰箱提取2 h，4层纱布过滤，滤液用2.5 mol/L H2SO4调pH至3.0，4 ℃冰箱静置2 h以上，静置期间pH值保持在3.0左右，然后用滤纸过滤，收集滤液待激活。将胰蛋白酶原的粗提取液用5 mol/L NaOH调节pH至8.0，量取溶液体积；加入固体CaCl2使溶液Ca2+的终浓度达到0.1 mol/L，再次检查溶液pH是否是8.0，若偏酸或偏碱，则用5 mol/L的NaOH或HCl精确调pH至8.0；然后，加入约50 mg标准胰蛋白酶，混匀，在4℃冰箱中激活12～16 h。在酶激活期间，经常检测酶的活性，取1 mL上清液分别测定胰蛋白酶的浓度和活性，待酶的比活达到1 000 u/mg时，用2.5 mol/L H2SO4调至pH至3.0，停止激活[9]。

2.1.3 猪胰蛋白酶的纯化

称取10 g Sepharose 4B置于玻璃烧结漏斗G-3中抽干，用100 mL 1.0 mol/L NaCl溶液抽洗3次，再用200 mL蒸馏水抽洗3次，抽干后转移到小三角瓶内。然后依次加入7 mL蒸馏水、8 mL 1，4二氧六环、6.5 mL 2 mol/L NaOH、1.5 mL环氧氯丙烷，用塑料薄膜将瓶口封住，在40℃的恒温水浴摇床中振摇活化2 h，然后将活化的Sepharose 4B转移到玻璃烧结漏斗中，抽去活化剂，用100 mL蒸馏水洗涤，少量多次，抽干，再将Sepharose 4B转移到100ml干净的三角瓶中备用。称取100 mg鸡卵粘蛋白用10 mL 0.2 mol/L pH9.5 Na2CO3缓冲液充分溶解，取0.1 mL稀释30倍后测定A280 nm，计算溶液中鸡卵粘蛋白的浓度，然后将溶解好的蛋白溶液加入到100 mL三角瓶中与活化的Sepharose 4混匀，在40℃恒温水浴中，以130～140 r/min振摇偶联22 h左右后，终止偶联。将已经偶联好的Sepharose 4B转移到玻璃烧结漏斗中，用100 mL 0.5 mol/L NaCl溶液洗去未被偶联的蛋白，收集的滤液，量取体积并在紫外分光光度计上测定未被偶联的鸡卵粘蛋白含量，以计算偶联蛋白量；然后用100 mL蒸馏洗，50 mL亲和柱洗脱液淋洗，蒸馏水洗至中性(大约pH6.0)。然后将亲和介质转移到小烧杯内，用亲和柱平衡液浸泡15 min脱气，装柱。取一支层析柱( 10×150 mm)柱内先装入1/4体积的亲和柱平衡液，将脱气的亲和吸附剂轻轻搅匀，一次装入柱内，待其自然沉降，调好流速(2～4 mL/10 min)。用亲和柱平衡液平衡，经紫外分光光度计测定A280 mm值小于0.02即可。将已经激活的胰蛋白酶提取液用5 mol/L NaOH精确调至pH8.0，过滤，取滤液20～50 mL上柱(通过亲和介质的偶联量和胰蛋白酶粗提液的比活性，计算出上样所需体积=)，上样体积(mL)=[介质偶联mg数×0.86×1.3×104(u/mg)] ×1.5 /胰蛋白酶粗提液浓度(mg/mL)×比活(u/mg)上完样以后，再以0.1 mol/L，pH8.0 Tris-HCl 缓冲液(内含0.5 mol/L KCl，50 mmol/L CaCl2)平衡，洗去未被吸附的杂蛋白，直至流出的平衡液经蛋白质核酸检测仪绘出的基线稳定。上柱后用亲和柱平衡液平衡，待流出液在经紫外分光光度计测定A280 nm值小于0.02以后，改用亲和柱洗脱液(0.1 mol/L pH2.5甲酸，0.5 mol/L KCl溶液)洗脱，收集第Ⅱ洗脱峰，即为纯化后的猪胰蛋白酶[10-11]。

2.1.4 纯胰蛋白酶活性和鸡卵粘蛋白抑制活性测定

测定鸡卵粘蛋白浓度时，先将透析液稀释30～50倍，然后用重蒸水作空白调零，在λ=280 nm时，测OD值(如测得的OD值大于1，接着再稀释)，然后计算卵粘蛋白的浓度(鸡卵粘蛋白浓度(mg/mL) =A280 nm×稀释倍数/0.413计算鸡卵粘蛋白的含量)。

测定鸡卵粘蛋白抑制活性时，在λ=253 nm时，将0.05 mol/L pH7.8 Tris-HCl缓冲液、标准胰蛋白酶和鸡卵粘蛋白直接加入比色杯中，混合2 min后(使胰蛋白酶和卵粘蛋白充分混合)；再加入2 mol/L BAEE底物，然后混合记时测定，30 s读一次共5次，以0.05 mol/L pH7.8 Tris-HCl缓冲液、2 mol/L BAEE底物、标准胰蛋白酶作无空白对照，测定透析液卵粘蛋白的抑制活性。鸡卵粘蛋白抑制活性单位(胰酶BAEE)=(未加抑制剂的胰蛋白酶△A253 nm/min-加入抑制剂胰蛋白酶△A253 nm/min)/ 0.001，鸡卵粘蛋白抑制比活性单位(胰酶BAEE/mg)=[抑制剂活性单位(胰酶BAEE)×抑制剂的稀释倍数]/ [抑制剂的浓度(mg/mL)×加入抑制剂的体积][7,11]。

测定标准胰蛋白酶活性时，先计算所需标准胰蛋白酶的体积，在λ=280 nm时，用重蒸水调零，测标准胰蛋白酶的浓度(胰蛋白酶浓度=A280 nm/1.35)，然后用5～10 μg(加入胰酶的量理论值)除浓度即为所得的体积数。在λ=253 nm时，将0.1 mol/L Tris-HCl pH8.0缓冲液和2 mmol/L BAEE底物直接加入比色杯，然后加标准胰蛋白酶(用盖子或硫酸纸盖上，上下翻转2或3次，立即计时)30 s读一次共5次，以0.1 mol/L Tris-HCl pH8.0缓冲液和2 mmol/L BAEE底物作无空白对照，测定纯胰蛋白酶的活性。胰蛋白酶活性单位(BAEE)=(△A253 nm/min)/0.001，胰蛋白酶比活性单位(BAEE/mg)=(胰酶活性U×稀释倍数)/ 胰酶浓度(mg/mL)×加入酶体积[8]。注意：测定时，鸡卵粘蛋白的抑制活性的光吸收递增值在△A253 nm/min (0.05±0.01)最适宜，测定胰蛋白酶反应的时间为5～7 min，测定鸡卵粘蛋白的抑制活性是胰蛋白酶的2～3倍时间或许更长。

在综合性实验-亲和层析法纯化胰蛋白酶中，以蛋白质化学、酶学的性质等内容组织教学，每一个实验的终产物都是下一个实验的材料，环环相扣，既很好的将不同单元的实验操作融合在了一起，又体现了综合性实验强调突出内容复合性、方法多元性、手段多样性的要求[12]，从而实现了实验教学内容、研究方法、手段的综合[13]。

2.2 综合性实验的设计

作为一个综合性实验，亲和层析法分离纯化猪胰蛋白酶主要围绕着蛋白质化学、酶学的性质等内容组织教学，选择有代表性的实验材料，根据分析的目标融入光谱、色谱、电泳等技术。在实验技术上，既要考虑内容和方法具有相互关联和完整性，又要考虑每一个单元侧重点和相对独立性。在实验项目的教学安排过程中，严格按照循序渐进的教学原则，按照鸡卵粘蛋白制备-粗胰蛋白酶制备及标准胰蛋白酶活性测定-亲和层析纯化胰蛋白酶的顺序合理安排教学内容，从而使教学过程符合认知科学的理论与实践[13]。

在鸡卵粘蛋白制备模块中，不仅融入了有机酸、有机溶剂沉淀蛋白质的基本技术，而且融入了柱层析技术分离纯化蛋白质的方法，更为重要的是将紫外吸收分光光度计测定蛋白质含量巧妙的引入实验中。在鸡卵粘蛋白粗提的操作步骤中，除了给定浓度、pH的三氯乙酸溶液以及丙酮外，启发学生通过查阅文献找出其他可以沉淀蛋白质的有机酸或有机溶剂，并亲自通过实验验证，同时指出选择10% pH1.15的三氯乙酸进行蛋白质沉淀的原理，如果沉淀后不调节pH至1.15，最后能否提取出鸡卵粘蛋白，同时思考将丙酮换成其他溶剂是否可以达到同样的目的。在鸡卵粘蛋白分离纯化的步骤中，使用了Sephadex G-25和 DEAE-32两种层析介质，为提高教学效果，使学生理解并掌握柱层析的基本实验技术，课前让学生提前预习，课上提问两种介质层析的原理、操作要点，以及层析过程中可能出现的层析峰，如何判断层析峰的开始与结束，什么时候开始流出的层析液中含有目标蛋白等。通过这种方式，将三氯乙酸提取鸡卵粘蛋白、丙酮沉降法分级分离、Sephadex G-25柱层析分离以及DEAE-32阴离子交换柱层析分离鸡卵粘蛋白的方法有机串联起来，蛋白质的提取、分离、纯化不再是一个个单元化实验操作，而是一个具体的可操作的完整的有机体。

在粗胰蛋白酶制备及标准胰蛋白酶活性测定模块中，不仅巧妙地融入酶原激活概念和方法，进一步加深了学生对酶和酶原这两个概念的理解，而且引入了酶抑制活性测定的概念和方法，从而将该模块与鸡卵粘蛋白制备模块有机结合起来。授课时，通过提问和释疑的方式，引导学生深入理解和区别酶活性和酶抑制活性的概念及其应用。如在猪胰蛋白酶原粗提过程中，使用的乙酸酸化水的作用是什么，它与三氯乙酸、丙酮在鸡卵粘蛋白制备中的作用有何异同？在静置提取过程中，pH值为什么要始终保持在2.5～3.0左右？在胰蛋白酶原激活过程中，为什么要加入CaCl2和固体胰蛋白酶，不加入酶原能否被激活？

在亲和层析纯化胰蛋白酶模块中， 亲和层析介质的制备方法、亲和层析分离纯化胰蛋白酶的技术流程、图谱分析技术以及纯化胰蛋白酶活性指标的测定与计算方法是考核的主要能力指标。并通过上一模块的产物猪胰蛋白酶粗提取液与本模块进行衔接，既保证了实验的连续性，又是对上一模块实验在内容和技术上的升华。猪胰蛋白酶粗提取液中既含有胰蛋白酶，又含有非胰蛋白酶，采用何种方式可以将猪胰蛋白酶分离出来呢？第一模块中用到的三氯乙酸沉淀、丙酮沉降法分级分离、Sephadex G-25柱层析分离以及DEAE-32阴离子交换柱层析分离蛋白质的方法是否依然使用呢？让学社带着这些问题去查阅文献，对比分析，寻找合适的分离出猪胰蛋白酶的方法，顺势引入Sepharose 4B亲和层析的技术与方法。胰蛋白酶分离提纯后，其活性指标测定和计算方法的学习也就顺理成章了。

在时间安排上，基本上按照鸡卵粘蛋白的制备、猪胰蛋白酶粗提液的制备以及亲和层析纯化猪胰蛋白酶的顺序安排实验，又不完全拘泥于上述实验各个步骤，如在猪胰蛋白酶粗提液的制备过程中穿插了Sepharose 4B亲和介质制备的内容，以达到充分利用各个步骤中的等待时间，提高实验效率的目的。总体上该综合性实验需要5 d，累计授课40学时，具体安排如下：第一天主要进行玻璃器皿的清洗、试剂配制、仪器设备的安装调试以及三氯乙酸提取鸡卵粘蛋白。第二天主要进行以丙酮沉降法分级分离、ephadex G-25柱层析分离以及DEAE-32阴离子交换柱层析分离等为主要内容鸡卵粘蛋白的分离纯化工作。第三天鸡卵粘蛋白纯品的获得、鸡卵粘蛋白含量及其抑制活性测定等内容。第四天主要进行猪胰蛋白酶原的提取、胰蛋白酶原的激活、胰蛋白酶的活性浓度及活性测定以及Sepharose 4B亲和介质的制备等内容。第五天主要进行亲和层析柱的安装与平衡、猪胰蛋白酶粗提液的上样、平衡与洗脱以及纯胰蛋白酶活性和鸡卵粘蛋白抑制活性的测定等内容。

可见，模块化的实验设置体系和循序渐进的教学过程安排，使学生在实验过程中变被动学习为主动学习，有利于逐步提高发现问题、分析问题和解决问题的能力, 增强对困难和失败的承受力, 并增进团队精神和协作能力[14]。

2.3 综合性实验的考核

由于过去过度依赖实验报告的优劣作为考评指标，导致学生不注重实验过程，片面追求实验结果的正确性、实验报告的篇幅和整洁程度，严重制约了对学生综合素质的培养[15]。为了提高学生实验过程中独立思考的能力和发现问题、分析问题、解决问题的能力，实行实验座谈、实验报告、实验考试综合评定学生的考核制度。该考核制度加大了对实验过程的考核力度，激发了学生主观能动性，符合江月玲[15]以及战春梅等[16]等构建的综合性实验教学质量评价体系思想，有利于培养和提高学生的实践能力和创新能力。

由于综合性实验周期相对较长，即便在授课过程中尽可能统筹安排，也难免会有较长的等待时间，为充分利用相对闲散的时间，专门设置了实验座谈环节，座谈由教师主持，各实验小组逐一阐述本组实验中出现的问题，并分析成功或失败的原因，其他组的同学进行点评，点评情况由老师测评并计入平时成绩。通过这样的讨论，使学生对各实验操作步骤及其原理有了更进一步的认识，有利于学生在掌握实验技能的同时，举一反三，能够将学到的方法和技术灵活运用到其他实验材料上。实验结束时，要求每位同学必须同时完成实验报告的撰写，包括结果计算、分析和讨论，严禁课后补写实验报告。设置实验课程考试环节，考试方式闭卷，内容包括试剂配制及其在实验中作用、实验原理、实验操作、实验结果分析等，全部为授课过程中涉及到的内容。上述三种方式的综合得分即为该综合性实验的最后得分，即实验成绩=实验座谈成绩×35%+实验报告成绩×35%+考试成绩×30%。

3 结 语

亲和层析法纯化猪胰蛋白酶实际上将蛋白质分离纯化、蛋白质含量测定以及酶活性测定等3个单元的实验有机融合在一起，形成了一个综合性和设计性于一体的实验项目，旨在培养和提高学生综合利用生物化学知识的能力与素质。经过多年的实践，学生们普遍反映，通过该实验不仅学到了多种实验技术和方法，而且获得了综合运用所学知识设计实验的思维。此外，该综合性实验的实践与探索为生物化学其他(如糖类、脂类、核酸)综合性实验项目设计提供了有益借鉴。

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Design and Implementation of a Comprehensive Experiment of Biological Chemistry — Separated and Purified Porcine Trypsin Using Affinity Chromatography for Example

HUANGTiran1,2,LIUYueping1,ZHANGGuoqing1,WANGgWenping1,ZHANGJing1

(1. College of Biological Sciences and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China; 2. Key Laboratory of Urban Agriculture (North) of Ministry of Agriculture, Beijing 102206, China)

Biochemistry experiment is an important professional basic course in the field of life science. The experimental technology contained in the biochemistry experiment played a vital role in training students’ basic skills, cultivating practical ability and innovation ability. Around the protein chemistry and enzymatic properties in the biochemistry, the experiments of chicken ovalin preparation, porcine trypsin preparation, porcine trypsin purification, and the determination of purified trypsin activity and chicken ovalin inhibitory activity were re-integrated. Therefore a comprehensive experiment including protein separation and purification, determination of protein content and enzyme activity was designed. The spectroscopy and chromatography were also used in the comprehensive experiment. Finally comprehensive designing content in the experiment was studied. The design can provide the reference for the research and development of comprehensive and designing experiments in the biochemistry experiment teaching.

biochemistry; comprehensive experiment; chromatograph; separated and purified

2016-05-20

北京农学院实验技术体系研发基金项目(SXST201606)，北京农学院学位与研究生教育改革与发展项目(2016YJS080)

黄体冉(1983-)，男，山东郓城人，硕士，实验师，研究方向：实验教学与管理、植物分类。

Q 503

A

1006-7167(2017)04-0179-05

Tel.: 010-80799294; E-huangtr151@bua.edu.cn