慢性阻塞性肺疾病患者外周血淋巴细胞NLRP3 mRNA的表达及血清IL-1β、IL-18检测的意义

毛建 宋珊 贾钦尧 陈绍平 韩美玲 廖俊蕾

慢性阻塞性肺疾病患者外周血淋巴细胞NLRP3 mRNA的表达及血清IL-1β、IL-18检测的意义

毛建 宋珊 贾钦尧 陈绍平 韩美玲 廖俊蕾

目的 通过对慢阻肺患者外周血淋巴细胞NLRP3 mRNA及血清中炎症介质IL-1β、IL-18的检测，探讨NLRP3炎症小体在慢阻肺发病中的作用。方法 选取60例确诊AE慢阻肺患者，根据有无呼吸衰竭，分为2组，每组30例，急性加重期患者经治疗症状体征好转达到缓解期水平后作为慢阻肺组，同期门诊健康体检者30例作为健康对照组。采用ELISA检测各个组血清中IL-1β、IL-18的浓度，采用PCR检测各组中NLRP3 mRNA的表达量。 结果 AECOPD组和慢阻肺缓解组患者的NLRP3 mRNA表达量和血清中IL-1β和IL-18的浓度均显著高于健康对照组(P<0.05); AE慢阻肺组患者的NLRP3 mRNA表达量和血清中IL-1β和IL-18的浓度均显著高于慢阻肺缓解组(P<0.05)；慢阻肺合并呼吸衰竭患者的NLRP3 mRNA表达量和血清中IL-1β和IL-18的浓度显著高于未合并呼吸衰竭患者(P<0.05)；慢阻肺患者NLRP3 mRNA表达量与血清中IL-1β、IL-18的浓度呈正相关，相关系数r分别为0.69和0.70(P<0.05)；IL-1β的浓度与IL-18的浓度呈正相关，相关系数r=0.65(P<0.05)。结论 NLRP3和IL-1β、IL-18参与慢阻肺的炎症反应，其浓度升高导致慢阻肺病情严重程度增加。

NRLP3 mRNA；慢阻肺；IL-1β；IL-18

NLRP3(NOD-like Receptor Family, Pyrin Domain Containing 3，NLRP3)是10号染色体1q44上的NLRP3基因编码的蛋白质。NLRP3分子、凋亡相关微粒蛋白(Apoptosis associated speck-like protein containing ASC)以及半胱天冬酶(caspase-1)共同组成的多聚蛋白复合物即为NLRP3炎症小体[1]。近年研究表明[2]，NLRP3与多种炎症性疾病密切相关，在炎症反应的急性期，NLRP3表达量明显增加，在炎症反应缓解期时其表达量又显著下降。但是NLRP3与慢阻肺的相关性研究相对较少，且目前研究结果不一致，尚没有定论。有研究显示[3]，IL-1β、IL-18在慢阻肺患者中的水平升高，是引起慢阻肺病情加重的重要因素。因此有必要进一步对NLRP3 mRNA和IL-1β、IL-18进行联合检测，探索它们在慢阻肺发生发展中的作用。

资料与方法

一、研究对象

选取2014年10月至2015年5月于川北医学院附属医院住院的60例确诊AECOPD患者，其中男性31例，女性29例，年龄70.43±7.92岁。AECOPD组根据有无呼吸衰竭，分为AECOPD合并呼吸衰竭组，其中男性16例，女性14例，年龄70.28±7.85岁。AECOPD未合并呼吸衰竭组，其中男性15例，女性15例，年龄70.76±8.12岁。急性加重期患者经治疗症状体征好转达到缓解期水平后作为慢阻肺组，同期门诊健康体检者30例作为健康对照组，其中男女各15例，年龄70.15±7.73岁。所有患者的诊断均符合《2015年GOLD指南》，且近4周无呼吸道感染史，无高血压、冠心病、心肌病、糖尿病、甲亢等疾病。所有患者均知情同意，各组间一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。

二、主要仪器和试剂

人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物公司，中国)，快速荧光定量PCR预混试剂(天根生化科技有限公司，中国)，实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(TakaRa公司, JAPAN)，Human IL-18 ELISA Kit(欣博盛生物科技有限公司，中国)，Human IL-1βELISA Kit(欣博盛生物科技有限公司，中国)；7900 RT-PCR仪(ABI公司，美国 )，Jaeger Master Screen肺功能检测仪(耶格公司，德国)，Infinite M2000 Pro多功能酶标仪(TECAN公司，瑞士)。

三、研究方法

1 设计引物

根据gene bank中的NLRP3和人肌动蛋白β-actin序列，由上海生物工程有限公司设计合成PCR引物。NLRP3与β-actin内参引物序列(见表1)。

2 荧光定量PCR检测NLRP3 mRNA表达 从外周静脉血中，分离出外周血单个核细胞(PBMCs)，提取总RNA，加30 μL无RNA酶水溶解RNA，逆转录合成cDNA，总反应体系20 μL，反应条件：扩增反应为95℃预变性1min；95℃ 5s，60℃ 15s，30次循环；72℃延伸5min。熔解反应为95℃ 15s，60℃ 15s，95℃ 15s。NLRP3 mRNA表达量计算：ΔCt=NLRP3Ct值-β-actin Ct值；ΔΔCt=实验组-对照组Ct值。2(-ΔΔCt)值表示NLRP3 mRNA相对表达量。

表1 NLRP3、β-actin基因引物序列及PCR扩增长度

3 检测血清中IL-1β、IL-18的浓度

采用双抗体夹心ELISA法，严格按照人IL-1β、人IL-18定量ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司，中国)说明书步骤检测各组血清中IL-1β、IL-18的浓度。

四、统计学方法

结 果

一、AECOPD组和慢阻肺缓解组患者的NLRP3 mRNA表达量和血清中IL-1β和IL-18的浓度均显著高于健康对照组(P<0.05); AECOPD组患者的NLRP3 mRNA表达量和血清中IL-1β和IL-18的浓度均显著高于慢阻肺缓解组，P<0.05，(见表2)。

二、慢阻肺组中合并有呼吸衰竭患者的NLRP3 mRNA表达量和血清中IL-1β和IL-18的浓度显著高于未合并呼吸衰竭患者，P<0.05，(见表3)。

三、慢阻肺患者NLRP3 mRNA表达量与血清中IL-1β、IL-18浓度呈正相关，NLRP3与 IL-1β相关系数0.69(P<0.05)；NLRP3与IL-18相关系数0.70(P<0.05)；IL-1β与IL-18相关系数0.65(P<0.05)。

表2 AECOPD组、慢阻肺缓解组与健康对照组NLRP3 mRNA相对表达量和血清IL-1β、IL-18浓度

注：与AECOPD组比较，aP<0.05；与慢阻肺缓解组比较，bP<0.05。

表3 AECOPD亚组和健康对照组NLRP3 mRNA相对表达量和血清IL-1β、IL-18浓度

注：与AECOPD组比较，aP<0.05；与慢阻肺缓解组比较，bP<0.05。

讨 论

NLRP3炎症小体是固有免疫系统的重要组成部分，内源性和外源性的多种危险信号均可激活NLRP3炎症小体，其活化后形成的多蛋白复合体可激活半胱天冬酶(caspase-1)，进一步加工IL-1β和IL-18的前体，形成并分泌IL-1β、IL-18等前炎症介质，激活下游一系列炎症反应[4-5]。IL-1β、IL-18属于IL-1家族，由单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等多种细胞分泌。L-1β可激活T淋巴细胞启动适应性免疫应答，招募炎症细胞至感染部位，引发炎症反应和组织损伤。IL-18最初从小鼠肝脏提取液中分离得到，被命名为INF-γ诱导因子[6]。近年研究发现[7]，香烟烟雾暴露、感染及吸入有害气体等可能通过共同的NLRP3炎症小体信号通路引起肺部及全身炎症反应，加快慢阻肺病情发展。

本研究结果显示：AECOPD组和慢阻肺缓解组中患者的NLRP3 mRNA表达量和IL-1β和IL-18的浓度均显著高于健康对照组(P<0.05)，AECOPD组患者的NLRP3 mRNA表达量和IL-1β和IL-18的浓度明显高于慢阻肺缓解组，差异有统计学意义(P<0.05)。推测NLRP3 mRNA表达水平在AECOPD组与慢阻肺缓解组之间的差异与病原微生物感染因素相关。感染是临床上引起慢阻肺急性加重最常见的诱因，感染引起慢阻肺患者病情急性加重时，病原微生物通过PAMPs刺激巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞，引起NLRP3 mRNA表达增加。经过抗感染治疗使症状缓解后，病原微生物数量下降，PAMPs减少，NLRP3 mRNA表达量亦随之下降。但是肺部持续性的炎症反应，引起炎症小体持续性活化，导致IL-1β、IL-18浓度进一步上升，通过促进下游炎症反应，加重患者的临床症状和肺组织的损伤，促进慢阻肺病情恶化和疾病进展[6,8]。

此外，AECOPD合并呼吸衰竭组患者的NLRP3 mRNA表达量和IL-1β和IL-18的浓度显著高于AECOPD未合并呼吸衰竭组，差异有统计学意义(P<0.05)。由于合并呼吸衰竭的患者多为长期反复住院者或体质差免疫功能低下者，因此推测广谱抗生素的长期使用、免疫功能低下等因素容易引起呼吸道病原微生物的定植以及二重感染的发生，可通过多种PAMAs活化更多的NLRP3炎症小体，造成这些患者肺部感染更重，进一步证实NLRP3炎症小体在慢阻肺的发生发展过程中具有重要作用，同时也说明IL-1β、IL-18浓度升高不仅促进肺部炎症反应，而且与病情严重程度相关，IL-1β、IL-18浓度升高，患者的症状也随之加重[8-9]。本研究还发现NLRP3 mRNA表达水平与IL-1β、IL-18表达水平呈正相关性，差异有统计学意义(P<0.05)。这与Rotta[10]等的研究结果一致。病原微生物感染、香烟烟雾暴露、吸入粉尘及有害气体等多种危险因素可通过PAMPs和DAMPs途径活化NLRP3炎症小体，进一步促进下游IL-1β、IL-18等炎症介质的成熟与释放，共同参与慢阻肺病情的进展。本研究结果进一步支持NLRP3和IL-1β、IL-18可能在同一信号通路上。

综上所述，NLRP3在慢阻肺的发病过程中具有重要作用，NLRP3的表达水平可能作为临床上评价慢阻肺病情的有价值指标之一，进一步研究NLRP3 炎症小体在慢阻肺中的作用，能够对慢阻肺的新药开发及临床治疗等提供新的思路。

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Significance of peripheral blood lymphocyte NLRP3 mRNA expression and IL-1β and IL-18 detection in COPD patients

MAOJian,SONGShan,JIAQin-yao,CHENShao-ping,HANMei-ling,LIAOJun-lei

DepartmentofRespiratoryMedicine,theAffiliatedHospitalofChuanbeiMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China

Objective To explore the role of NLRP3 inflammasome in the occurrence and development of COPD through the detection of NLRP3 mRNA in peripheral blood lymphocyte and the concentration of IL-1β and IL-18 in plasma of COPD patients. Methods 60 patients with AECOPD were selected and divided into 2 groups according to whether there was no respiratory failure, 30 cases in each group. Patients with acute exacerbation of symptoms and signs after improvement to achieve remission level were taken as the COPD group, and 30 cases of healthy people at the same period were selected as the control group. The concentration of IL-1β and IL-18 was measured by ELISA method and the expression of NLRP3 mRNA was measured by qRT-PCR. Results The level of NLRP3 mRNA and the concentration of IL-1β and IL-18 in plasma of patients with AECOPD or stable COPD was significantly higher than that of the control group (P<0.05). The level of NLRP3 mRNA and the concentration of IL-1β and IL-18 in plasma of the AECOPD group was obviously higher than that of the stable COPD group (P<0.05). The level of NLRP3 mRNA and the concentration of IL-1β and IL-18 in plasma of the respiratory failure group was notably higher than that of the without respiratory failure group (P<0.05). The correlation was positive between the level of NLRP3 mRNA and the concentration of IL-1β and IL-18, and the correlation coefficient r equal to 0.69 and 0.70, respectively (P<0.05). The correlation was positive between the concentration of IL-1β and IL-18 (r=0.65,P<0.05). Conclusion NLRP3 and IL-1β, IL-18 involve in the inflammatory reaction of COPD, and the increase of the concentration can cause a serious increase in the severity of the disease.

NRLP3 mRNA; COPD; IL-1β; IL-18

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.026

四川省教育厅基金项目支持(No 16ZB023)

637000 四川 南充，川北医学院附属医院呼吸内科

陈绍平，E-mail：chenshaoping836@163.com

2016-10-24]