两种典型手性有机氯农药对大型蚤的对映体选择性毒性

杨华云, 高勤芬

(1. 杭州师范大学钱江学院,浙江 杭州 310036； 2. 杭州格临检测有限公司,浙江 杭州 311188)

两种典型手性有机氯农药对大型蚤的对映体选择性毒性

杨华云1, 高勤芬2

(1. 杭州师范大学钱江学院,浙江 杭州 310036； 2. 杭州格临检测有限公司,浙江 杭州 311188)

采用“OECD 化学品测试准则”和“化学农药环境安全评价试验准则”方法,选择无脊椎动物大型蚤Daphniamagna为受试生物,以手性α-HCH、o.p′-DDT外消旋体及其对映体作为目标污染物,在环境相关浓度下,对大型蚤进行急慢性毒性研究.结果表明,两种手性有机氯杀虫剂对大型蚤急慢性毒性均表现出显著的对映体选择性差异.α-HCH外消旋体及其(+)-α-HCH和(-)-α-HCH对D.magna的48 h-LC50值分别为1.47，1.12和1.98 mg/L；o.p′-DDT外消旋体及其(+)-o.p′-DDT和(-)-o.p′-DDT对D.magna的48 h-LC50值分别为0.27，0.52和0.18 mg/L.慢性毒性实验表明,(+)-α-HCH在质量浓度大于10 μg/L时对大型蚤的体长造成显著的抑制作用；α-HCH外消旋体及其(+)-α-HCH在质量浓度大于10 μg/L时对大型蚤的内禀增长率造成显著的影响.

有机氯杀虫剂；手性；急性毒性；慢性毒性；大型蚤

有机氯农药(Organochlorine Pesticides, OCPs)是20世纪60—80年代初中国使用量最大的一类农药[1],被大量用于防治农林害虫及卫生害虫,在植物保护和卫生防疫上发挥了重要作用.《斯德哥尔摩合约》更是将9种OCPs认定为典型的持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants, POPs),包括艾氏剂(Aldrin)、狄氏剂(Dieldrin)、异狄氏剂(Endrin)、氯丹(Chlordane)、滴滴涕(DDT)、七氯(Heptachlor)、灭蚁灵(Mirex)、毒杀酚(Toxaphene)和六氯苯(Hexachlorobenzene).因其具有半挥发性和长距离迁移性,有机氯农药能够通过“全球蒸馏效益”在各个环境介质中迁移,从而导致污染在全球范围内传播[2]；另外,它们对生物降解、光解、化学分解作用具有较强的抵抗能力,一旦通过多种形式进入环境介质中,可以在环境中存留数十年甚至上百年[3].OCPs虽然自20世纪70年代始已在全球范围内陆续被禁用,中国也于1983年开始禁用,但由于使用量大、在环境中滞留时间长,仍广泛残留于世界的各个角落[4-6],而且这一类化合物具有高毒性和生物积累效应[7],能导致免疫系统毒性,影响生殖和发育,干扰内分泌系统,具有致癌和人体器官组织病变等作用,严重影响人类健康和生态安全,已引起科学家的持续关注.

OCPs大多具有手性特征,如滴滴涕、六六六、氯丹、狄氏剂、异狄氏剂、七氯、毒杀芬等.手性农药的一对对映异构体的化学和物理性质几乎相同,但生物活性、毒性及代谢行为等却存在着极大的差异甚至是相反的作用[8-12].然而到目前为止,在进行类似手性农药的环境毒理和环境风险评价时,并未考虑对映异构体的生物活性差异,仍将手性农药作为外消旋体农药来处理,导致环境毒性研究和环境风险评价存在缺陷.这就要求研究者必须从对映异构体层面来研究手性农药污染的对映体选择性,从而更客观地揭示手性农药的真实危害,为环境治理和研制开发高效、低毒、低残留的新型农药提供依据.本文以环境毒理评价中常用的大型蚤Daphniamagna作为受试生物,选择两种典型的手性有机氯杀虫剂,研究其对大型蚤48 h的急性毒性和21 d的慢性毒性,了解手性农药对大型蚤的急慢性毒性的对映体选择性差异.

1 材料与方法

1.1 供试材料

外消旋的α-HCH(rac-α-HCH,纯度大于99%)和o.p′-DDT(rac-o.p′-DDT,纯度大于99%)溶液标准样品购自中国标准物质中心.以上药剂用正己烷配成一定浓度的贮备液,于0～4 ℃冰箱内保存.配置培养基的各无机盐均为分析纯,购自杭州汇普化学试剂有限公司.

大型蚤Daphniamagna为从中国预防医学科学院环境和卫生工程研究所生物毒理室引种的纯大型蚤62D.M生物株,选用OECD推荐的M4培养基作为D.magna的培养液.斜生栅藻Scemedesmusobliquus购自中国科学院武汉水生生物所藻种库,在实验室采用水生四号培养液同步培养.水温(21±1) ℃,光照与黑暗比16 h∶8 h,光照强度控制在3 000～4 000 lx.为保证斜生栅藻在生长过程中保持悬浮状态,每天人工摇动培养液5～6次.大型蚤的饲养密度控制在1只/50 mL培养液,并且每隔两天换一次培养液.每天喂食斜生栅藻,密度控制在每毫升含2.0×105～3.0×105个藻类细胞.在此基础上,挑选出生不足24 h的幼蚤用于手性农药的急慢性毒性试验,幼蚤的敏感度测定采用国标方法[13]进行.

1.2 试验方法

1.2.1 α-HCH和o.p′-DDT对映体的制备及判定

α-HCH和o.p′-DDT对映体在日本分光公司(Jaseo, Tokyo, Japan)的Jasco LC-2000系列高效液相色谱系统上进行拆分.采用的液相色谱柱为ChiraleelOJ-H(0.46 cmi.d.×25 cm, Daicel Chemical industries, Tokvo, JaPan),100%乙醇作为流动相,液相色谱进样体积为20 μL,流速为0.4 mL/min,圆二色(CD)检测器的波长为240 nm,液相色谱柱温为25 ℃.配备有电子捕获检测器(electronca pturedetector, ECD)及Agileni色谱工作站的Agilent公司的6890N气相色谱(gas chromatograPh, GC)用于对映体的判定及定量.采用BGB-172手性气相色谱柱(30 m,0.25 mmi.d.,0.25 μm film thickness; BGB Analytik AG, Anwil, Switzerland).进样口温度250 ℃；检测器温度300 ℃；程序升温条件:起始温度90 ℃,保留1 min,以20 ℃/min升温到160 ℃,再以1 ℃/min升至190 ℃,保持80 min,最后以20 ℃/min升至225 ℃,保持40 min.拆分开的两个对映异构体在高效液相色谱的出口处分别收集、旋干,用于后续生物实验.

1.2.2 急性毒性测定

按照国标方法[13]进行,分别记录大型蚤24和48 h的LC50,中间不喂食.根据预试验得出的浓度范围设置5～7个等对数间距浓度,1个空白对照,每个浓度平行4组,试验容器为50 mL烧杯,盛20 mL试验溶液,水温20～22 ℃,光照周期为16 h光照,8 h黑暗,分别得出24 h-和48 h-LC50.

1.2.3 慢性毒性测定

慢性毒性实验按照OECD标准方法[14]进行.为了更好观察大型蚤在手性农药作用下各参数的变化,实验在50 mL烧杯中进行,每个烧杯中放入6～24 h幼蚤一个,每一浓度(包括对照)设置20个平行样.试验温度控制为20～22 ℃,光照强度为(1 500±100) lx,光照周期为16 h光照,8 h黑暗,试验历时21 d.根据48 h-LC50和慢性的预试验设置5个等对数间距浓度,1个空白对照.采用半静态试验方法,用新鲜的栅藻喂养大型蚤,每天更换1次试验溶液.更换试验溶液的同时取出新生幼蚤,并且记录母蚤第一次怀卵和产卵的时间及产卵量,统计整个试验过程中大型蚤的产卵次数和产卵量.在实验的第21天时取出大型蚤在显微镜下测量并记录其体长.采用Lotka方程∑lxmxe-rx=1[15]计算内禀增长率r.其中lx为第x天每只大型蚤的存活率,mx为每只母蚤在第x天的产卵数.

1.2.4 数据处理

急性毒性LC50值采用蓝宙工作室的LC50数据处理软件得到,其原理是机率值分析法(Probitnaalysis)[16],最后由Excel制表得出.慢性毒性试验数据经SPSS处理,比较组间的差异.

2 结果与分析

2.1 大型蚤敏感性毒性实验结果

以重铬酸钾为敏感性测定毒物,对大型蚤进行24 h-EC50(24 h半数运动受抑制)试验,评价本实验室的大型蚤是否符合敏感性要求.实验结果表明,大型蚤的重铬酸钾24 h-EC50值为1.52 mg/L,符合国标大型蚤敏感性要求(0.9～1.7 mg/L),可以作为标准试验生物进行毒理试验,对毒物进行评价.

2.2 手性有机氯农药对大型蚤的急性毒性

根据标准方法,测试了24和48 h手性有机氯农药α-HCH和o.p′-DDT的外消旋体、正对映体、负对映体对D.magna的急性水生毒性,每个实验重复3次,所得LC50值见表1.结果显示,α-HCH和o.p′-DDT的外消旋体、正对映体、负对映体对D.magna的急性毒性差异很大:α-HCH的正对映体对D.magna的急性毒性远远大于负对映体；o.p′-DDT情况则相反,其负对映体对D.magna的急性毒性远远大于正对映体；而外消旋体,无论是α-HCH还是o.p′-DDT,对D.magna的急性毒性都介于两个对映体之间.表2所示为手性有机氯农药对鱼类和蚤类依LC50值大小进行的毒性分类[17].根据这一标准,有机氯杀虫剂α-HCH及其对映体属于中毒等级,而有机氯杀虫剂o.p′-DDT及其对映体属于高毒等级.

表1 手性α-HCH和o.p′-DDT对D.magna的对映体选择性急性毒性

Tab. 1 LC50for racemate and enantiomers of α-HCH ando.p′-DDT toD.magnamg/L

化合物24h-LC5048h-LC50α-HCH外消旋体4.27±0.141.47±0.23(+)-对映体3.21±0.181.12±0.06(-)-对映体4.74±0.221.98±0.15o.p'-DDT外消旋体0.74±0.040.26±0.08(+)-对映体1.27±0.050.55±0.17(-)-对映体0.45±0.090.20±0.05

表2 化学物质对鱼类和水蚤的毒性等级评价标准

Tab. 2 Criteria for evaluating and grading toxicity of chemicals to fish and daphnia mg/L

毒性等级鱼类毒性LC50水蚤毒性LC50极毒—<0.1高毒<0.10.1～1.0中毒0.1～10.01.0～10.0低毒>10.010.0～100.0微毒—>100.0

2.3 手性有机氯农药对大型蚤的慢性毒性

手性有机氯农药α-HCH对大型蚤F1代母蚤第一次怀卵时间、第一次产卵时间、第一次产卵数、幼蚤数、胎数、体长和内禀增长率等的影响见表3.可以看出:50,100,200 μg/L的α-HCH正对映体对大型蚤的体长造成显著影响,而α-HCH的负对映体和外消旋体在实验浓度下对大型蚤的体长均无显著影响.超过10 μg/L的α-HCH正对映体和外消旋体对内禀增长率影响显著,而α-HCH的负对映体仅在超过100 μg/L时对内禀增长率造成显著影响.

手性有机氯农药o.p′-DDT对大型蚤F1代母蚤的存活、生长及繁殖等影响见表4.从表4可以看出,大型蚤的各项指标都受到不同程度的影响.当o.p′-DDT及其正对映体、负对映体的质量浓度超过1 μg/L时,大型蚤F1代母蚤的胎数和内禀增长率都受到明显的抑制.暴露于5 μg/L的o.p′-DDT的负对映体对大型蚤第一次怀卵时间产生了显著的影响,而各浓度o.p′-DDT的正对映体对第一次怀卵时间均无显著影响.

表3 α-HCH对F1代大型蚤的慢性毒性实验结果Tab. 3 Result of chronic test of α-HCH to F1 generation of D.magna

注:表内数据为平均值±标准差(n=20)；同一列内具有相同字母表示差异不显著,不同字母则显著(P<0.05).以下同.

表4 o.p′-DDT对F1代大型蚤的慢性毒性实验结果Tab. 4 Result of chronic test of o.p′-DDT to F1 generation of D.magna

3 讨论

实验结果表明,手性有机氯农药α-HCH和o.p′-DDT对大型蚤D.magna的急慢性毒性是具有对映体选择性差异的.其他学者也获得了类似α-HCH对映体选择性毒性的结果,即(+)-对映体的毒性>(-)-对映体的毒性.如Wang等[18]发现(+)-苯线磷对映体对D.magna的急性毒性是(-)-苯线磷对映体的20倍；Yen等[19]研究发现对溴磷的外消旋体、正对映体和负对映体对D.magna的急性毒性LC50值分别是0.040 9，0.038 7和0.802 g/L；Lin等[20]也发现甲胺磷的正对映体对D.magna的急性毒性是负对映体的7.0倍.另外,还有一些研究得到了类似o.p′-DDT对映体选择性毒性的结果,即(-)-对映体>(+)-对映体.如Liu等发现手性有机磷农药地虫磷和丙溴磷的负对映体对D.magna的急性毒性要远远大于外消旋体和正对映体[8],并证实另一种手性有机磷农药壤虫磷的负对映体对D.magna的急性毒性是正对映体的8～11倍[21].然而到目前为止,世界上商品化的手性有机磷杀虫剂和手性有机氯杀虫剂都是以外消旋的形式运用到现代农业中,并且往往只有其中一个对映体具有药效.因此从对映体层面来研究手性有机氯杀虫剂的环境行为,特别是对映体选择性的毒性差异具有重要意义.

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Enantioselective Toxicity toDaphniamagnaof Two Type Chiral Organochlorine Pesticides

YANG Huayun1, GAO Qinfen2

(1. College of Qianjiang, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China; 2. Hangzhou Green Testing Co., Ltd, Hangzhou 311188, China)

Using OECD guidelines for testing of chemicals and chemical pesticide environmental safety assessment testing criteria, choosingDaphniamagnaas the tested organism, this thesis evaluated acute and chronic toxicity of racemate and enantiomers of α-HCH ando.p′-DDT toDaphniamagna. The results showed that enantio-selectivity was observed for acute and chronic toxicity of two chiral OCPs toD.magna. The 48 h-LC50of rac-α-HCH, (+)-α-HCH and (-)-α-HCH toD.magnawere 1.47, 1.12 and 1.98 mg/L, respectively. And 48 h-LC50of rac-o.p′-DDT, (+)-o.p′-DDT and (-)-o.p′-DDT toD.magnawere 0.27, 0.52 and 0.18 mg/L, respectively. The results of chronic toxicity showed that parameters such as length was significantly affected at (+)-α-HCH concentration higher than 10 μg/L, rac-α-HCH and (+)-α-HCH of > 10 μg/L significantly prolonged the intrinsic rate of natural increase (r).

organochlorine pesticides; chirality; acute toxicity; chronic toxicity;Daphniamagna

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.03.009

2016-09-20

国家自然科学基金项目(21207030)；杭州市属高校中青年学术带头人项目(杭教高师[2013]45号).

杨华云(1983—)，男，副教授，主要从事环境化学与毒理研究.E-mail：yanghuayun119@163.com

S482.3

A

1674-232X(2017)03-0273-05