实验性前导斜度改变的大鼠模型的建立及其颞下颌关节滑膜组织病理学观察

李雨轩 翟桐 谭文宏 白乐康 肖敏

西安交通大学口腔医院修复科，西安 710004

实验性前导斜度改变的大鼠模型的建立及其颞下颌关节滑膜组织病理学观察

李雨轩 翟桐 谭文宏 白乐康 肖敏

西安交通大学口腔医院修复科，西安 710004

目的 建立稳定的前导斜度改变的大鼠模型，探索其对大鼠颞下颌关节（TM J）滑膜的组织病理学影响。

方法 将32只大鼠随机分为4组，分别是对照组（C）、前导缺失组（T1）、前导斜度增大15°组（T2）、前导斜度增大30°组（T3）。在大鼠上前牙粘接舌侧增大15°、30°金属冠改变相应前导斜度。采用低速金刚砂轮打磨大鼠上下前牙，使下颌在各个方向运动时上下牙切缘不接触，造成前导缺失。3、7、14、28 d各处死2只。实验结束后取大鼠一侧TM J作石蜡切片苏木精-伊红（HE）染色，通过组织病理学诊断鉴定大鼠TM J滑膜的改变。结果 T1组体重短暂下降后缓慢增加（P<0.05），T3组体重明显下降后略回升，但始终低于初始体重（P<0.05），T3组滑膜衬里细胞增生，血管扩张明显（P<0.05）。结论 本研究所建立的前导斜度增大30°大鼠模型能较好地模拟临床上前导斜度过大造成的TMJ滑膜出现的组织病理变化过程。提示前导斜度增大越多，发生TMJ滑膜损伤的风险越大。而前导缺失对TMJ滑膜的影响有待进一步确定。

前导斜度； 前导缺失； 颞下颌关节； 滑膜

前导的概念最早由Broderson在1978年提出，是指在下颌各个方向的功能运动中上下颌前牙接触关系。Donegan等[1]发现前牙修复中存在过度恢复前牙舌侧厚度和形态的情况。并提出了过度的恢复上切牙舌侧面的外形来增加与下切牙的接触关系是不正常的，可能是有害的。在临床中，也观察到类似的病例，调磨其舌侧过厚的外形后，患者出现的颞下颌关节（temporomandibular joint，TM J）不适症状有所减轻或消失。

前导对下颌前伸、侧方运动具有主要引导作用，下颌运动时前导使后牙脱离咬合接触，减少后牙干扰引起的下颌异常运动，其是维持口颌系统健康的重要因素，滑膜及滑膜液的改变已经成为临床上诊断颞下颌关节紊乱病（temporomandibular disorders，TMD）的根据之一，而关于前导与TMJ滑膜的相互关系及影响的研究较少。本研究通过模拟前导斜度增大和缺失的情况，建立大鼠动物模型，以此为基础探讨其对大鼠TM J滑膜的改变作用和程度，为修复和正畸治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组

选取由西安交通大学医学院动物实验中心提供的雌性SD大鼠32只，体重220~260 g，随机分为4组，每组8只，分别为对照组（C）、前导缺失组（T1）、前导斜度增大15°组（T2）、前导斜度增大30°组（T3）。实验期为28 d。

1.2 前导缺失及前导斜度增大的处理方法

1.2.1 建立前导缺失动物模型 采用低速连柄砂轮同时打磨大鼠上下前牙，消除上下牙在下颌各方向运动时的接触；每2 d打磨一次，按第一次磨牙后的牙长度数据作参照处理。

1.2.2 建立前导增大动物模型 用硅橡胶制作大鼠前牙局部托盘，待托盘成形后再次用硅橡胶给大鼠前牙取模，灌制超硬石膏模型，在模型上用自凝造牙树脂制作舌侧增大15°、30°冠（此角度为上牙舌面与冠舌面的夹角即为前导斜度增大的角度）。将做好的树脂牙冠翻制铸造成金属冠。在麻醉、隔湿条件下将金属全冠粘接在SD大鼠上颌双侧前牙上。对照组不做处理，实验结束之前在同样情况下饲养。隔日记录体重数据和金属冠在口内维持情况（图1）。

1.3 标本的处理

于实验后3、7、14、28 d每组各处死2只，10%水合氯醛0.003 m L·g-1腹腔注射，麻醉大鼠，主动脉插管快速推进生理盐水，继续灌注4%多聚甲醛，取一侧完整TM J关节（另一侧关节滑膜取出为下一步实验所用），置于40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h后，EDTA中脱钙1个月，常规脱水，石蜡包埋，沿矢状方向连续切片，厚度为5 μm。

图 1 动物模型示意图Fig 1 Schematic diagram of animal model

1.4 组织形态学染色及图像分析

每个标本取正中矢状面2张切片，共计64张，常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，在Olympus DP71显微照相系统下采图，对各样本于× 40倍镜下，DP Controller软件中观察关节盘后部双板区被覆的滑膜组织（图2），评估滑膜组织形态学变化。由两名观察者盲法观察免疫组化染色结果，随机选择不重叠的10个视野，人工计数，计算该区域内计数等级，3次计数的均值被用于后续的统计分析。染色结果的评判标准[2]如下。滑膜细胞层数：0级：1~3层；1级：4~6层；2级：≥7层。血管扩张：0级：未出现；1级：累及小于滑膜长度的1/3；2级：累及滑膜长度的1/3~2/3；3级：累及大于滑膜长度的2/3。纤维素沉积：同血管扩张。

1.5 统计学分析

采用统计软件SPSS 20.0对实验结果进行分析，体重数据采用4×4析因设计的方差分析。不同时间组间差异采用重复测量的方差分析，差异无统计学意义。故析因设计时选择处死最终体重作为结局指标。HE染色结果的等级资料采用多样本的秩和检验分析，所有样本采用双侧检验，检验水准为0.05，组间比较据比较次数将水准调整为0.05/6=0.008。

图 2 大鼠TM J矢状面切片示意图Fig 2 Schematic diagram of a sagittal section of the rat’s TMJ

2 结果

2.1 体重变化

C组动物随着鼠龄增加，体重逐渐增加；T1组体重短暂下降后缓慢增加；T2组体重呈缓慢增加；T3组体重下降明显后略回升。根据析因分析结果，不同实验组间体重变化有统计学意义（P<0.05）；不同时间组体重变化无统计学差异；而处理分组与时间存在的交互作用具有显著差异（P<0.05）。两两比较显示：T3组与T2和C组比较差异有统计学意义（P<0.05），T1与C组比较差异有统计学意义（P< 0.05），其他方式处理组间两两比较均无统计学意义（P>0.008）（图3）。

图 3 析因设计各组大鼠体重结果图Fig 3 The changes of rat’s weights between the four groups by fac- torial design

2.2 TMJ滑膜组织改变

TMJ滑膜组织改变见图4、表1。

图 4 TM J滑膜组织观察结果 HE × 40Fig 4 Histomorphology changes in the synovial tissue of the TMJ HE × 40

表 1 各组样本滑膜组织形态学变化结果Tab 1 The morphological changes of synovial tissue in each group

不同组间滑膜细胞增生、血管扩张、纤维素沉积均有统计学差异（P<0.05）。C组TM J关节盘双板区附近滑膜细胞1~2层，表面光滑，滑膜下层中的血管未见扩张，未出现炎性改变的证据；与C组相比，T3组滑膜衬里细胞增生，1~2级，血管扩张明显（P<0.008）。两两比较结果，与T3组相比，T1组滑膜层数轻度增生（P>0.008），3 d时纤维素沉积（P>0.008），轻度血管扩张（P<0.008）；T2组滑膜不同时期层数为0级（P<0.008），滑膜下层的血管7 d时扩张（P<0.008），几乎无纤维素沉积（P<0.008）。

3 讨论

本实验选用大鼠作为研究对象是基于Weijs等[3]研究出其咀嚼运动和TMJ结构与人具有一定类似性。解决前导装置在大鼠前牙固位的最大一个问题就是大鼠切牙不断伸长，固位装置会随着切牙伸长不断移动，妨碍了持续而精准的实验干预且影响大鼠的咀嚼进食。针对这个问题，Schour等[4]给一只大鼠的切牙做冠阻止了切牙的萌出。研究发现在大鼠下切牙上放置牙冠后，出现了釉质有机成分的萎缩，釉基质形成终止，牙源性上皮折叠，实验表明牙冠的形式干扰了切牙的正常磨耗和生长，在动物前牙实验中具有重要的意义。

因金属咬合板和树脂均难以在大鼠切牙舌侧长期固位，且这两种改变前导斜度的装置会随着切牙不断生长而移位，造成干扰。故本研究采用给大鼠上切牙粘接舌侧增大15°、30°的金属冠来构建前导斜度增大的动物模型，这与A rce等[5]的研究结果一致，即牙冠干扰了上切牙的磨耗和生长，在大鼠切牙粘接牙冠后的1个月实验期内，牙冠保持稳定，上切牙停止生长且长度无明显变化。

本实验模拟了临床上有学者[1,6]提出的上前牙修复体舌侧过陡而增加了前导角度的情况和Kerstein等[7]在临床上注意到前导缺失伴有TMD症状的情况，以及Guinn等[6]提出了前导角度尤其重要的情况，这些临床问题都提示前导改变造成了对TMJ的不良影响。大鼠前牙前导可变空间较大，前导增大30°时上前牙牙冠舌侧面紧贴下前牙唇面，下颌前伸的轨迹几乎是先垂直向下到切缘再向前运动，伴有轻微的下颌后退。故本实验将大鼠增加的前导角度最大值定为30°。并设立前导增大15°组，以达到梯度对比的目的，所有动物在相同条件下饲养排除了其他因素的干扰。

前导增大30°时大鼠体重先明显降低，后缓慢升高（P<0.05）；前导缺失时大鼠体重短暂下降后缓慢增加（P<0.05），因进食量与体重直接相关，此两种改变造成了大鼠进食困难，随后推测咀嚼肌及TM J形成了某种补偿，进食量逐步增加，体重有所回升。

TMJ滑膜内衬细胞通常为1~4层，在正常情况下细胞分裂速度极低，但在急性创伤或不良刺激作用下，滑膜细胞迅速增殖[8]。滑膜下血管神经丰富，因此非常容易出血。在前导斜度增大30°组，血管扩张3 d时出现（P<0.05），滑膜细胞增生明显，伴有一定程度的纤维素沉积，且随时间并未减轻。说明此时TM J受到了一定的创伤和刺激，其发生的可能机制是前导斜度增大到30°，引起了髁突后退，对双板区滑膜皱襞的压力增大，这与陈彩云[9]建立的咬合创伤模型对大鼠TM J滑膜影响的研究结果有一定相似性。

在前导斜度增大15°组，未见明显的炎症改变，仅在3、7 d观察到滑膜下血管的轻度扩张。说明前导斜度增大15°的改变还不足以引起TMJ滑膜的改变。或者在建模最初即引起了滑膜改变，但在第3天改变已被代偿。

在前导缺失组，3 d时滑膜细胞出现轻度增生和轻度血管扩张、纤维素渗出，而随后的时间点滑膜均未见明显炎症改变，这与孙莲等[10]建立的大鼠前牙开 ，丧失前导而引发的TM J骨关节炎样退变的结果并不一致，其原因可能是本实验前导缺失模型并未使用对大鼠持续张口的方法，关节腔压力并无明显变化，主要是以血管扩张及毛细血管通透性升高，血管中的纤维蛋白渗出到血管外为主要反应的变化。

综上所述，前导增大30°可导致TMJ滑膜出现炎症性改变，前导斜度增大30°可能是不影响大鼠生存前导增大的极限角度，这提示临床前导斜度越陡，发生TM J滑膜炎症的风险越大。而前导缺失引起了大鼠TM J滑膜的急性炎症，可在短期内很快消失，由此推测大鼠前导缺失不足以引起严重而持续的滑膜炎症。

[1] Donegan SJ, Knap FJ. A study of anterior guidance[J]. J Prosthodont, 1995, 4(4):226-232.

[2] Muto T, Kawakam i J, Kanazawa M, et al. Development and histologic characteristics of synovitis induced by trauma in the rat temporomandibular joint[J]. Int J Oral Maxillofac Surg, 1998, 27(6):470-475.

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[4] Schour I, Massler M. The teeth[M]. Philadelphia: JB Lippincott Company, 1949:104-160.

[5] Arce C, Erausquin J. Supresión experimental de la erupción en los incisivos de la rata[M]. Rev Odontol: Buenos Aires, 1944.

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[7] Kerstein RB, Farrell S. Treatment of myofascial pain-dysfunction syndrome with occlusal equilibration[J]. J Prosthet Dent, 1990, 63(6):695-700.

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[9] 陈彩云. 咀嚼力降低状态下升高咬合对青春期大鼠颞下颌关节滑膜的影响[D]. 西安: 第四军医大学, 2009.

Chen CY. Weaker masticatory muscles affects temporomandibular joint synovitis induced by increase of occlusal vertical dimension in adolescent rats[D]. Xi’an: The Fourth M ilitary Medical University, 2009.

[10] 孙莲, 张卫兵, 王林. 开 诱导大鼠颞下颌关节骨关节炎样退变的实验性研究[J]. 口腔医学, 2016, 36(5):390-393.

Sun L, Zhang WB, Wang L. Experimental study of inducing an osteoarthritis-like lesion in the rat temporamandibular joint by mouth-opening[J]. Stomatology, 2016, 36(5):390-393.

（本文编辑 杜冰）

Establishment of rat models with altered anterior guidance and observation of histological changes in tem poromandibular joint synovium

Li Yuxuan, Zhai Tong, Tan Wenhong, Bai Lekang, Xiao Min. (Dept. of Prothodontics, Stomatology

Hospital of Xi’an Jiao Tong University, Xi’an 710004, China)

Supported by: Key Science and Technology Foundation of Shanxi Province (2012k16-10-03). Correspondence: Xiao Min, E-mail: 1968143838@qq.com.

ObjectiveThis study aims to establish a stable animal model with altered anterior guidance and investigate histological changes on temporomandibular joint (TMJ) synovium in rats. Methods Thirty-two rats were divided into four groups, namely, control group, anterior-guidance-deficient group (T1), and anterior guidance inclined up to 15 degree (T2) and 30 degree (T3) groups. Metal crowns that add 15 and 30 degrees to the palatal side were cemented to the incisors of maxilla to increase the inclination of anterior guidance. The low-speed diamond wheel shorts for both upper and lower incisors of rats were applied to avoid contact between anterior teeth in all direction, thus establishing an anterior guidance deletion model. TMJ joints on one side of two animals in each group were harvested after 3, 7, 14, and 28 days. Pathological changes were investigated in the TMJ synovium using hematoxylin-eosin (HE) staining.ResultsThe weight of T1 decreased briefly at first, and then increased slightly (P<0.05). The weight of T3 obviously reduced and then slow ly increased, but remained below the initial weight (P<0.05). T3 manifested obvious synovial lining proliferation and vascular dilation (P<0.05).ConclusionThe rat model of anterior guidance inclined up to 30 degree could im itate the pathological features of TMJ synovium with excessive increase in anterior guidance. A higher inclination of anterior guidance m ight cause more damage of TMJ synovium. The effect of anterior guidance deletion on TMJ synovium is yet to be determined.

inclination of anterior guidance; anterior guidance deficiency; temporomandibular joint; synovial membrane

R 782.6

A

10.7518/hxkq.2017.03.005

2016-06-03；

2017-03-10

陕西省社会发展科技攻关基金（2012k16-10-03）

李雨轩，主治医师，硕士，E-mail：1206502414@qq.com

肖敏，副主任医师，硕士，E-mail：1968143838@qq.com