大枣总黄酮的提取及百分含量测定

王福玲，高 原，杨 波，刘 丽，耿豪滨，伊亚彤

(1. 哈尔滨商业大学 药学院 细胞与分子生物学研究所，哈尔滨 150076；2. 哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076)



大枣总黄酮的提取及百分含量测定

王福玲1,2，高 原1,2，杨 波1,2，刘 丽1,2，耿豪滨1,2，伊亚彤1,2

(1. 哈尔滨商业大学 药学院 细胞与分子生物学研究所，哈尔滨 150076；2. 哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076)

探讨大枣总黄酮的最佳提取工艺条件.选定乙醇体积分数、料液比、提取时间及提取温度4个因素，进行单因素考察和正交试验，再根据芦丁标准曲线，测定大枣中总黄酮百分含量，研究4个因素对总黄酮的影响，最终确定最佳工艺条件.大枣总黄酮的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数70%、料液比1∶10、提取时间3 h、提取温度80 ℃，在此条件下，大枣总黄酮百分含量为0.875 5%.回流提取法提取总黄酮简便、快速、节省溶剂，且有较高的得率.

大枣；总黄酮；提取；正交试验；百分含量测定

大枣为鼠李科植物大枣(Zizyphus Jujube Mill.)的成熟果实，其中富含的丰富营养成分以及生理活性物质赋予了大枣的多种保健功能，是一种难得的药食同源的保健医疗佳品[1].大枣中主要活性成分是黄酮类化合物，是广泛存在于自然界的一大类化合物，大枣中的黄酮具有体外抗氧化、抗肿瘤、抗心血管疾病、抗病毒、抗过敏、抗辐射、提高机体免疫力等作用[2].我国大枣的产量居世界首位，本文探讨了大枣总黄酮提取的最佳工艺，以期为大枣资源的应用提供依据，促进大枣产业化的发展.

1 材料与仪器

大枣购自沃尔玛超市，产地为新疆.

芦丁标准品(≥98%，四川维克奇生物科技有限公司)；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试剂均为国产分析纯.

T6紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；精密电子分析天平(Sartorius)；RE-2000真空旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；HH-2数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器有限公司)；高速万能粉碎机(上海一恒科学仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海科导超声仪器有限公司).

2 方 法

2.1 提取工艺

大枣→清洗→干燥→粉碎→加入提取溶剂(乙醇)→热水回流提取→离心(3 000 r/min，10 min)→上清液(粗提液)→浓缩→浸膏

2.2 单因素考察和正交试验

选择乙醇体积分数(%)、料液比(g/mL)、提取时间(h)及提取温度(℃)，分别进行单因素实验[3].在单因素实验的基础上，采用L9(34)进行正交试验设计.

2.3 总黄酮百分含量测定

2.3.1 标准曲线的制备

精密称取芦丁标准品10 mg，用蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，配成0.1 mg/mL的溶液.精密量取芦丁标准品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于5 mL容量瓶中，各加5% NaNO2溶液0.2 mL，摇匀，静置6 min，再加10% Al(NO3)3溶液0.2 mL，摇匀，静置6 min，最后加入10% NaOH溶液2.0 mL，摇匀，并用蒸馏水定容至5 mL.放置15 min后，以不加芦丁标准品的溶液为空白，于510 nm处分别测定吸光度[4]，以质量浓度(C, μg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，以质量浓度对吸光度进行回归，计算回归方程.

2.3.2 大枣总黄酮百分含量的测定

将黄酮浸膏0.1 g溶于5.0 mL的60%乙醇溶液中，取0.2 mL样品溶液于5 mL容量瓶中，按2.3.1项下操作测定吸光度.根据回归方程计算提取液中总黄酮百分含量[5].X为在Y吸光度下根据回归方程计算所得的值.

2.4 方法学考察

分别考察紫外分光光度法测定总黄酮方法的精密度、稳定性、重复性和加样回收率.

2.5 验证实验

采用最佳提取工艺条件，重复提取3次，计算大枣中总黄酮的平均百分含量.

3 结果与结论

3.1 标准曲线的制备

以吸光度(A)为纵坐标，标准品质量浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，经回归处理得线性回归方程为：Y=0.011 3X-0.000 4，r=0.996 5，线性范围0～20 μg/mL.

3.2 单因素考察

3.2.1 乙醇体积分数

在料液比1∶15，60 ℃条件下，乙醇体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%，提取2 h，结果见图1.随着乙醇体积分数的增加，总黄酮先升后降，乙醇体积分数为50%时最高，可能是由于大枣总黄酮在50%的乙醇水溶液中溶解性能较好.因此选取的3个水平为50%、60%、70%.

图1 乙醇体积分数对总黄酮百分含量的影响

3.2.2 料液比

在60 ℃，70%乙醇条件下，料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，提取2 h，结果见图2.当料液比为1∶10时，总黄酮的百分含量较高，料液比增加后百分含量并未提高，考虑到浓缩工艺和成本问题，料液比也不宜过大.因此选取的3个水平为1∶5、1∶10、1∶15.

图2 料液比对总黄酮百分含量的影响

3.2.3 提取时间

在料液比1∶15，70%乙醇，60 ℃条件下，提取时间分别为1、2、3、4、5 h，结果见图3.提取时间在3 h前，黄酮呈上升趋势，3 h时，达到最高，此后下降，可能是提取过程中的杂质影响了提取效果，从而减少了总黄酮的提取率，导致黄酮百分含量下降.因此选取的3个水平为2、3、4 h.

图3 提取时间对总黄酮百分含量的影响

3.2.4 提取温度

在料液比1∶15，70%乙醇条件下，提取温度分别为40、50、60、70、80 ℃，提取2 h，结果见图4.随着温度的升高，总黄酮百分含量逐渐增加，可能是随着温度的升高，黄酮分子运动加剧，加速了溶出.综合考虑节约能源，因此选取的3个水平为60、70、80 ℃.

图4 提取温度对总黄酮百分含量的影响

3.3 正交试验

见表1、2.

表1 正交试验结果及极差分析

注：*有显著性影响

由正交试验表可知，提取大枣总黄酮的最佳工艺条件为A3B2C2D3，即乙醇体积分数70%，料液比1∶10，提取时间3 h，提取温度80 ℃.方差分析表明，4个因素对大枣总黄酮百分含量影响的主次顺序为D>A>B>C.

3.4 方法学考察

3.4.1 精密度

取芦丁标准品溶液6份，平行测定吸光度，计算RSD值为1.55%，表明精密度、准确性良好.

3.4.2 稳定性

取样品溶液，每隔10 min测定一次吸光度，连续测定1 h，计算RSD为1.22%，在不同时间所测得的吸光度表明该显色反应在1 h内吸光度稳定性良好.

3.4.3 重复性

取同一批次样品6份，制备样品溶液，测定吸光度，计算RSD为2.64%，表明重复性较好.

3.4.4 加样回收率

精密称取一定量芦丁标准品，加入到已知百分含量的样品溶液中，测定吸光度，加样回收率的平均值为99.1%，RSD为0.51%，表明此实验方法测定黄酮类化合物的百分含量，结果准确，方法可靠.

3.5 验证实验

大枣中总黄酮的平均百分含量为0.8755%，与理论值0.88%基本一致.

4 讨 论

大枣不但味美，而且对人体具有多种益处，在我国产量丰富.根据最大吸收波长扫描可知，大枣中总黄酮的最大吸收在510 nm，紫外可见分光光度法测定大枣中总黄酮的百分含量，操作简便快速、灵敏、重现性好、结果稳定.黄酮具有较强的清除自由基和抗氧化能力，热水回流提取得到的总黄酮百分含量较高，利于进行工业化生产，可以推广，继续研究其药理活性和加工工艺，可对大枣的深加工提供一定依据.

[1] 郭 琳. 大枣现代研究分析[J]. 中医学报, 2014, 29(4): 543-545.

[2] 王 军, 张宝善, 陈锦屏. 红枣营养成分及其功能的研究[J]. 食品研究与开发, 2003, 24(1): 68-72.

[3] 林建原, 陶志华, 朱钐汕, 等. 杨梅叶中总黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2011, 32(20): 26-29.

[4] 邸 娜, 郑喜清. 植物天然成分黄酮类化合物的提取方法[J]. 安徽农业科学, 2014, 42(33): 11888-11907.

[5] 沈广志, 郭 强, 何志鹏. 分光光度法测定大枣中总黄酮的百分含量[J]. 微量元素与健康研究, 2011, 28(4): 26-27.

Optimization of extraction and determination of total flavonoids from jujube

WANG Fu-ling1,2, GAO Yuan1,2, YANG Bo1,2, LIU Li1,2, GENG Hao-bin1,2, YI Ya-tong1,2

(1. Institute of Cell and Molecular Biology, School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. Research Center of Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

To investigate the optimum technology conditions of extraction of flavonoids from jujube. The single-factor experiment and orthogonal test were conducted to examine the optimum technology conditions. Four factors were selected, including ethanol concentration, ratio of solid to liquid, extraction time and extraction temperature. Optimal extraction conditions for flavonoids were ethanol concentration of 70%, ratio of solid to liquid of 1∶10g/mL, extraction time of 3 h and extraction temperature of 80 ℃. Under the conditions, the yield of total flavonoids was 0.875 5%. The method of reflux extraction of flavonoids was simple, rapid, save solvent, and have a high efficient.

jujube; total flavonoids; extraction; orthogonal test; contents determination

2016-10-21.

国家级创新项目(201610240025)；黑龙江省教育厅科技项目(12541204)

王福玲(1986-)，女，博士，工程师，研究方向：中药药理.

R284

A

1672-0946(2017)03-0268-04