两种半纤维素酶在毕赤酵母中的共表达

2017-06-22 09:06杨青张莉张华山熊海容
湖北农业科学 2017年10期
关键词:共表达

杨青++张莉++张华山++熊海容

摘要:基于定向改造的木聚糖酶(DSB)和甘露聚糖酶(ManA),通過不同的整合位点和抗性标记实现这两种酶在同一宿主GS115中的整合与筛选,获得了共表达菌株GS115/DSB-ManA。其热稳定性检测结果表明,该共表达菌株产出的DSB与ManA均有较高的热稳定性。重组菌株两种酶的成功表达为复合酶制剂的研究和生产奠定了基础。

关键词:木聚糖酶(DSB);甘露聚糖酶ManA;毕赤酵母(Pichia pastoris);共表达

中图分类号:Q19 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2017)10-1971-02

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.043

Co-expression of Two Hemicellulases in Pichia pastoris

YANG Qing1,ZHANG Li1,ZHANG Hua-shan2,XIONG Hai-rong1

(1.College of Life Science,South-central University for Nationalities,Wuhan430074,China;2.Key Laboratory of Fermentation Engineering,Ministry of Education,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

Abstract:Based on the directional modification of xylanase(DSB) and mannan(ManA) synthase genes in our laboratory,the co-expression of these two hemicellulases was successfully achieved in a Pichia cell by different integration sites and resistance markers. And the recombinant strain GS115/DSB-ManA was obtained. The thermal stability test showed that the DSB and ManA produced by the co-expressed strain had high thermal stability. The successful expression of the two enzymes of the recombinant strain laid a foundation for the research and production of the complex enzyme preparation.

Key words:xylanase (DSB); mannanase (ManA); Pichia pastoris; co-expression

β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)和β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)均属于半纤维素酶,分别水解半纤维素中的β-1,4-木糖苷键和β-1,4-甘露糖苷键。木聚糖为半纤维素中最丰富的一类[1],在木聚糖酶的作用下可被降解为国际市场上急需的低聚木糖和木糖。甘露聚糖作为半纤维素第二大组分[2],广泛存在于木材以及植物的块茎和种子中。

随着对半纤维素酶的深入研究,其应用领域也在不断的扩展,并拥有一个广泛的工业酶应用市场,包括食品和饲料、咖啡萃取、生物乙醇生产、杀黏菌剂、制药、纺织、洗涤、造纸、石油、天然气工业及生物技术等领域[3,4]。工业生产中,不仅需要高活力的酶,还需要酶在酸性环境、碱性环境或高温条件下保持稳定的酶学特性[5],同时也希望减低生产成本而提高效益。本试验研究了木聚糖酶与甘露聚糖酶的共表达,实现了这两种酶在毕赤酵母中的稳定共表达,使工业生产中有效地减少生产成本及相关处理环节。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种与质粒 大肠杆菌Top10细胞、表达载体pAO815hr为中南民族大学生命科学学院实验室保藏与构建。毕赤酵母GS115和表达载体pPICZαA为中国农业科学院饲料研究所惠赠。

1.1.2 工具酶及试剂限制性内切酶 T4 DNA连接酶等工具酶和DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司;燕麦木聚糖和角豆胶购自Sigma公司;Tryptone、Yeast Extract购自于Oxoid公司;无氨基酵母氮源(YNB)、D-sorbitol、Agar购自Biosharp公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.1.3 培养基和抗生素 毕赤酵母抗性选择平板YPDSZ(含终浓度100 μg/mL Zeocin),毕赤酵母组氨酸缺陷型选择平板MD,毕赤酵母生长/诱导培养基BMGY/BMMY,大肠杆菌生长培养基LB/LBL,毕赤酵母生长培养基YPD等培养基配方见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。氨苄青霉素(Ampicillin Sodium Salt)购自Biosharp公司;博来霉素(Zeocin)购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖酶DSB与甘露聚糖酶ManA重组表达质粒的构建及筛选 采用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ分别双酶切木聚糖酶DSB基因和表达载体pAO815hr,连接后转化,涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板上;同样用EcoRⅠ和NotⅠ分别双酶切甘露聚糖酶ManA基因和表达载体pPICZαA,连接后转化,涂布于含有博来霉素的LB固体平板上。菌落PCR验证后双酶切鉴定筛选出阳性克隆菌株DSB-pAO815hr-Top10和ManA-pPICZαA-Top10。

1.2.2 木聚糖酶与甘露聚糖酶共表达重组菌的构建及筛选

1)GS115/pAO815hr-DSB重组菌的构建及筛选。采用SalⅠ线性化重组质粒DSB-pAO815hr,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,挑取100个该共表达重组菌的单菌落使用BMGY/BMMY诱导产酶,使用DNS法[6]检测酶活力,依据酶活力高低筛选出酶活力较高的重组菌株GS115/pAO815hr-DSB。

2)共表达重组菌GS115/DSB-ManA的构建及筛选。采用SacⅠ线性化重组质粒ManA-pPICZαA,电击转化GS115/pAO815hr-DSB感受态细胞[7],按上述方法筛选出共表达重组菌株GS115/DSB-ManA。

1.2.3 GS115/DSB-ManA产甘露聚糖酶与木聚糖酶热稳定性的检测 将发酵上清液在不同温度下准确处理30 min,迅速置于冰上冷却,分别在DSB最适温度(75 ℃)与 pH(6.5)下与木聚糖底物反应和在ManA最适温度(75 ℃)与 pH(6.0)下与角豆胶底物反应,使用分光光度计检测OD540 nm,以每种酶最高酶活力为100%,计算各酶在其他温度处理后的相对残余酶活力,每组试验均重复3次,取平均值作为最终结果。

1.2.4 SDS-PAGE电泳 发酵结束后,取GS115/DSB-ManA与两种酶单一表达菌株的上清液进行SDS-PAGE电泳分析,具体操作方法参考《分子克隆实验指南》第二版。

2 结果与分析

2.1 木聚糖酶(DSB)与甘露聚糖酶(ManA)重组表达质粒的构建

将DSB基因片段连接到pAO815hr上,获得表达质粒pAO815hr-DSB;将ManA基因片段连接到pPICZαA上,获得表达质粒pPICZαA-ManA,物理图谱如图1所示,双酶切验证以上重组质粒构建成功。

2.2 热稳定性分析

如图2所示,GS115/DSB-ManA中木聚糖酶在45~70 ℃下处理30 min能够保持85%以上相对酶活力,但经过70 ℃以上温度处理后,相对酶活力降低较为明显;甘露聚糖酶在45~75 ℃下处理30 min后仍能保持90%以上相对酶活力,但经过75 ℃以上温度处理后,相对酶活力降低较为显著。

2.3 SDS-PAGE分析

结果(图3)表明,GS115/DSB-ManA发酵上清液中出现两条电泳条带,分别与单一表达DSB和ManA发酵上清液对比。GS115/DSB-ManA能够同时表达出两种半纤维素酶蛋白,且产物杂、蛋白的分泌量偏低。GS115/DSB-ManA分泌木聚糖酶蛋白较分泌甘露聚糖酶蛋白量高。

3 讨论

目前木聚糖酶与甘露聚糖酶已成功应用于工业农业生产的诸多领域,且通常是木聚糖酶和甘露聚糖酶联合使用从而达到协同增效。pPIC9K和 pPICZαA质粒同属于毕赤酵母分泌型表达质粒,本试验通过不同的整合位点和抗性标记实现了DSB和ManA在同一宿主中的整合与筛选,成功构建了共表达菌株GS115/DSB-ManA,实现了目标酶的共同生产,同时检测出其分泌的两种半纤维素酶有较高的热稳定性,为进一步工业化生产复合酶奠定了基础。

参考文献:

[1] 付 正,张华山,曾小英,等.嗜热真菌木聚糖酶1YNA的表达和定点突变[J].湖北农业科学,2011,50(7):1487-1493.

[2] SCHELLER H V,ULVSKOV P. Hemicelluloses[J].Annual Review of Plant Biology,2010,61:263-289.

[3] SITTIKIJYOTHIN W,TORRES D,GON?覶ALVES M P.Modelling the rheological behaviour of galactomannan aqueous solutions[J].Carbohydrate Polymers,2005,59(3):339-350.

[4] PRAKRAM S C,NEENA P,PRINCE S,et al. Mannanases: Microbial sources, production, properties and potential biotechnological applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology 2012,93:1817-1830.

[5] 張建新,赵丹丹,刘起丽,等.产β-甘露聚糖酶内生菌的筛选及酶学特性分析[J].微生物学通报,2011,38(8):1172-1178.

[6] 余红英,孙远明,王炜军,等.枯草芽孢杆菌SA-22 β-甘露聚糖酶的纯化及其特性[J].生物工程学报,2003,19(3):327-331.

[7] WANG Y W,SHI P J,LUO H Y,et al. Over-expression and characterization of an alkali-tolerant endo-β-1,4-mannanase from Penicilliumfreii F63[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2012,113(6):710-714.

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