HPLC法同时测定蛇床子配方颗粒中蛇床子素、花椒毒酚、花椒毒素的含量研究*

河北中医学院 河北省中药配方颗粒工程技术研究中心

张 闯 田 伟 王 相 牛丽颖(石家庄 050091)



方 药 研 究

HPLC法同时测定蛇床子配方颗粒中蛇床子素、花椒毒酚、花椒毒素的含量研究*

河北中医学院 河北省中药配方颗粒工程技术研究中心

张 闯 田 伟 王 相 牛丽颖(石家庄 050091)

目的：通过对蛇床子配方颗粒的定性鉴别和定量分析研究，制定更加完善的蛇床子配方颗粒质量控制标准。 方法：以蛇床子配方颗粒为对照品，采用高效液相色谱(HPLC)法同时测定蛇床子配方颗粒中蛇床子素、花椒毒酚、花椒毒素3种成分的含量。 结果：含量测定中，以测定的峰面积为纵坐标，蛇床子素在 0.04 ～0.40 μg范围内，呈线性关系( r2= 0.993)； 花椒毒酚在 0.04 ～ 0.40 μg范围内，呈线性关系( r2= 0.994)；花椒毒素在0.04 ～ 0.40 μg范围内，呈线性关系( r2= 0.996)；线性关系良好；平均回收率分别为99.53%、98.13%和101.46% (n= 6)，准确度良好。结论：本方法重复性良好，实验结果稳定可靠，完善和提高了蛇床子配方颗粒的质量控制标准。

蛇床子配方颗粒；高效液相色谱法；控制质量；蛇床子素；花椒毒酚；花椒毒素；指纹图谱

蛇床子Cnidiummonnieri(L.) Cuss. 是伞形科植物蛇床的成熟果实，经过自然风干后制得的药物，具有温肾壮阳、杀虫止痒以及燥湿祛风的功效。根据中医古籍记载，临床上肾虚阳痿、湿痹腰痛、阴痒带下、湿疹瘙痒、宫冷不孕的治疗可以应用蛇床子进行治疗。外用时，控制剂量，多煎汤熏洗，或研末调敷。[1-3]蛇床子主要的药效成分为蛇床子素、花椒毒酚、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素、异茴芹素等香豆素类化合物，[4]如图1。由于这些化合物同属香豆素类，在结构上具有相似之处，因此再对中药蛇床子进行有效成分的定性分析和定量分析都有一定的难度。

蛇床子配方颗粒是蛇床子经过提取、分离、提纯、浓缩、干燥和制粒等现代中药制药技术加工所得，其疗效已经得到临床验证。目前，中药配方颗粒的质量标准没有一个全国性的统一标准。国内所有生产中药配方颗粒的企业，都应用企业内部的标准对其生产的中药配方颗粒进行质量控制。针对这种情况，国家食品药品监管总局在2015 年12 月发布了《中药配方颗粒管理办法(征求意见稿)》，在这个《管理办法(征求意见稿)》中，明确要求各中药配方颗粒生产企业生产的中药配方颗粒，应体现多成分和整体质量控制。药典中，蛇床子的检测鉴定只针对蛇床子素单一指标进行定性和定量鉴别，所以蛇床子配方颗粒的生产企业也仅仅对蛇床子素单一成分进行鉴别和含量测定，因此进一步完善和提高蛇床子配方颗粒的质量标准很有意义。本研究按照 2015 版《中国药典》一部的方法，并参考相关的文献，[5-7]采用高效液相色谱(HPLC)法能够同时测定蛇床子配方颗粒中蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素 3 种香豆素类成分的含量。同时，笔者还比较了同一厂家，不同生产批次的蛇床子配方颗粒样品中这3种香豆素类成分的含量差异，并建立了蛇床子配方颗粒HPLC的指纹图谱，通过计算各批蛇床子配方颗粒相似度，能够对蛇床子配方颗粒进行综合质量评价。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪：Waters e2695 HPLC仪，Waters 2489型紫外检测器，Waters高效液相色谱LC工作站；电子分析天平:ME204E/02(梅特勒-托利多)，Milli-Q超纯水机，乙腈为色谱纯，水为超纯水，实验中其他试剂均为分析纯。

1.2 试药 实验中所用的蛇床子素对照品，购自中国食品药品检定研究院( 批号: 110822-201308)；花椒毒素和花椒毒酚对照品购自成都普菲德生物技术有限公司，花椒毒酚批号：16090904、花椒毒素批号：151019；蛇床子配方颗粒(批号：15022711、15032811、15031411)由石家庄神威药业集团有限公司提供。

图1 蛇床子中含有的主要香豆素类成分

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 将对照品蛇床子素、花椒毒素和花椒毒酚在80℃条件下干燥至恒重，3种对照品均精密称取2 mg，分别放置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解至容量瓶刻度，超声30 min，即得蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素的对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备 取在 80℃ 条件下干燥至恒重的供试品蛇床子配方颗粒(批号：15022711)粉末约0.1 g，精密称定，将其加入至具塞锥形瓶中，随后精密加入甲醇溶剂25 mL，称定重量，超声30 min，放冷至室温；再次称定重量，将减少的重量补足，摇匀，取大小合适的滤纸过滤，即得蛇床子配方颗粒的供试品溶液。

2.3 色谱条件 色谱柱，XBridge C18 柱 ( 4.6×250 mm, 5 μm)；流动相：乙腈(A) - 0. 1% 醋酸水(B)；流速，1 mL/min；梯度洗脱程序为：0 ～ 15 min，23% ～ 45% A；15 ～ 30 min，45% ～ 100% A；30 ～ 45 min，100% A；检测波长，322 nm；柱温，40℃；理论板数按蛇床子素峰计算应不低于3 000。其HPLC色谱图见图2。

注：1为花椒毒酚，2为花椒毒素，3为蛇床子素

2.4 线性关系 分别精密吸取3种香豆素对照品溶液 2、6、10、15、20 μL，按 “2.3” 项色谱条件测定这3种香豆素类成分的线性关系。以测定的蛇床子素的峰面积作为纵坐标，蛇床子素的进样量为横坐标，绘制标准曲线，结果显示，蛇床子素在0.04 ～ 0.40 μg范围内，呈线性关系，回归方程为：Y =82 075X-58 477，r2= 0.993；以测定的花椒毒酚的峰面积为纵坐标，花椒毒酚的进样量为横坐标，绘制标准曲线，结果显示，花椒毒酚在0.04 ～ 0.40 μg范围内，呈线性关系，回归方程为：Y =44 397X-32 648，r2= 0.994；以测定的花椒毒素的峰面积作为纵坐标，花椒毒素的进样量为横坐标，绘制标准曲线，结果显示，花椒毒素在0.04 ～ 0.40 μg范围内，呈线性关系，回归方程为：Y =38 486X-28 028，r2= 0.996；蛇床子素、花椒毒素和花椒毒酚3种对照品的线性关系良好。

2.5 精密度 精密吸取蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素对照品溶液10 μL，依照“2.3”项所述色谱条件连续进样6次，蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素色谱峰面积RSD值分别为 0.48 %、0.34%和1.94%，结果均小于2%，说明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密称取干燥处理的供试品蛇床子配方颗粒(批号：15022711)约0.1 g，室温放置，按上述供试品溶液的制备方法制备该批次蛇床子配方颗粒供试品溶液。分别在0、2、4、6、8、10、12、18 h ，精密吸取蛇床子配方颗粒供试品溶液10 μL，按“2.3”项所述色谱条件分别进样测定，最后根据实验数据，计算蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素峰面积RSD值分别为0.71 %、1.97%和0.58% (n=8) ，小于2% ，结果表明蛇床子配方颗粒供试品溶液在 18 h 内稳定。

2.7 重复性考察 分别精密称取干燥处理的同一批蛇床子配方颗粒样品( 批号：15022711) 6份，每份约0.1 g，室温放置，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取10 μL，依照 “2.3”项所述色谱条件进样，记录峰面积，计算含量。最后根据实验数据，计算得供试品溶液蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素含量RSD值分别为1.72 %、1.71%和1.93% (n=6) 小于2% ，结果表明样品测定重复性良好。

2.8 准确度考察 参考《中国药典》和其他相关文献，作者决定采用加样回收法对蛇床子配方颗粒样品准确度进行考察。取同一批样品(批号：15022711)6份，每份约0.05 g，精密称定，室温放置。精密加入一定量蛇床子素对照品、花椒毒酚对照品和花椒毒素对照品，按供上述供试品溶液制备方法制备，依“2.3”色谱条件测定，记录峰面积，计算含量。根据实验结果，3种香豆素类对照品的平均回收率分别为99.53%、98.13%和101.46%(n=6)。

2.9 3批样品含量测定 采用上述色谱方法，记录峰面积，计算含量。对本品3批样品中的蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素含量进行测定，结果详见表1。

表1 3批样品中的蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素含量结果

序号批号蛇床子素(mg/g)花椒毒酚(mg/g)花椒毒素(mg/g)1150227116 217 842 512150328116 248 572 483150314116 618 592 63

3 讨论

中药蛇床子具有多种药理作用：有抗心律失常、扩张血管、降低血压、保护心血管等心血管方面的药效作用；有镇静、镇痛、促进小鼠学习和记忆等中枢神经系统方面的药效作用；有降血脂、促进成骨细胞增殖、分化等内分泌系统方面的药效作用；有杀精作用和性激素样生殖系统方面的药效作用；有提高抗炎的免疫系统方面以及非特异性免疫功能的药效作用。与此同时，蛇床子还具有抗菌、抗病毒、抗诱变、抗肿瘤等作用。蛇床子中含有的药效成分主要以香豆素类为主，故本实验中，蛇床子配方颗粒的质量控制选择蛇床子中含有的3种香豆素类成分。

蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素这3种香豆素类化合物的极性差比较大，故采用梯度洗脱方法。经过对比实验，并参考相关文献，[2，4]最终确定乙腈-0.1%醋酸水溶液为流动相，检测波长为322 nm。本研究以药典方法为基准，[1]建立了蛇床子配方颗粒中蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素3种香豆素类化合物HPLC定量分析方法，加强了蛇床子配方颗粒的质量控制。本方法简便、快捷、有效，3种化合物在HPLC图谱中辨析度高，很好的体现了目前《中药配方颗粒管理办法(征求意见稿)》中对中药配方颗粒质量控制的新要求，从整体方面和多成份方面控制质量，结果表明，本方法可对不同批次蛇床子配方颗粒的质量差异进行全面评估，通过同时测定蛇床子素、花椒毒酚和花椒毒素这3种结构相似的香豆素类成分的含量，能够显著提高蛇床子配方颗粒的质量控制水平。

与此同时，研究人员还注意到蛇床子配方颗粒中的其他香豆素类成分在蛇床子配方颗粒HPLC图谱中也有对应的色谱峰，本次研究的结果，为将来更全面地进行蛇床子配方颗粒中药效成分的定性鉴别和定量测定，奠定了基础。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：化学工业出版社，2015. 315-316

[2]杨宪，杨水平，张雪.蛇床子药材的高效液相色谱指纹图谱[J].药学学报，2007，42(8)：877-881

[3]刘亚倩，胡亚刚，牛晓峰.蛇床子中蛇床子素提取工艺研究[J].现代中医药，2016，36(2)：79-81

[4]宋丽娇，李晋，姜艳，等.蛇床子香豆素类成分的含量测定及指纹图谱研究[J].天津中医药，2016，33(6)：368-372

[5]陈艳，张国刚，余仲平.蛇床子的化学成分及药理作用的研究进展[J].沈阳药科大学学报，2006，23(4)：256-260

[6]陈培胜，廖彩震，张文惠，等.蛇床子配方颗粒标准研究[J].环球中医药，2011，4(1)：28-30

[7]徐以亮，徐海波，李松.HPLC测定独活药材及配方颗粒中蛇床子素的含量[J].中成药，2005，27(1)：105-106

(2017-03-16 收稿)

*河北省高等学校科学技术研究项目：No.ZD2015001；河北省中医药管理局资助项目：No.2017017；河北中医学院青年基金项目：No.700201601201420

牛丽颖，女，教授，硕士研究生导师。

R284.2

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1007-5615(2017)03-0034-03