芝麻香曲中功能酵母菌的初步研究

张龙云，张聪芝，李燕荣，蒲 春

（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）

芝麻香曲中功能酵母菌的初步研究

张龙云，张聪芝，李燕荣，蒲 春

（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）

采用稀释涂布法，从酒醅、大曲及环境中筛选到29株酵母菌，从中进一步的筛选出11株酵母菌为研究对象，进行研究。同时，将11株菌株按照等比混合应用于芝麻香曲的生产，确定发酵培养条件。结果表明，酵母菌曲的最适培养条件为水分53%，pH5.0，培养温度32℃，培养时间36 h。

芝麻香曲； 功能酵母菌； 等比混合

芝麻香型白酒对我国白酒发展作出了重大的贡献，是一种高档次的白酒。芝麻香型白酒具有典型的复合焦香特性[1]，对改善酒体绵柔度和丰满感有重要作用。

芝麻香曲是生产芝麻香型白酒的关键环节，曲质的好坏直接影响酒的品质[2]。在芝麻香型白酒的酿造过程中，复合生香酵母是除白曲外的第二类重要微生物[3]。芝麻香型白酒的酿造过程中应用的复合酵母主要有酿酒酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属和汉逊氏酵母属等。各种酵母按照一定比例混合培养，制成复合菌系，为芝麻香风味形成提供了丰富的物质基础。

为进一步探索功能微生物在芝麻香曲生产中的应用，对应用于芝麻香曲生产的功能酵母进行系统研究，为研究芝麻香型白酒的风味物质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、培养基与仪器

材料：酒醅和大曲作为样品，从中进行筛选。

培养基：酵母平板及斜面培养基为麦芽汁琼脂培养基；酵母种子培养基为麦芽汁液体培养基；酵母麸皮培养基为麸皮加适量无机盐培养基；种子培养基灭菌条件为121℃灭菌20 min；麸皮培养基灭菌条件为121℃灭菌20 min。

仪器[4]：HS-3E台式pH计，LDZH-200KBS立式灭菌锅，DNP-9162A电热恒温培养箱，岛津气质联用仪，HW-150C温控振荡培养箱，90-3恒温双向磁力搅拌器，BP20奥林巴斯显微镜，血球计数板。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的处理和菌悬液的制备

将采集得到的样品采用四分法混合均匀后，-4℃冰箱保存备用。称取混合样品1 g，倒入装有99 mL灭菌去离子水和玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡30 min，制成菌悬液，然后静置澄清，取上清液作10倍逐级稀释至适当倍数。

1.2.2 酵母的分离、纯化和鉴定

取菌悬液，梯度稀释至适宜浓度，涂布于麦芽汁琼脂平板，30℃培养24 h，选取不同菌落特征的酵母菌纯化获得纯菌种，并参照《真菌鉴定手册》[5]和《微生物学分类》[6]初步鉴定，保存于斜面培养基中。

1.2.3 分析方法

pH值采用全自动pH计测定；微量风味物质采用顶空固相微萃取联合气质联用（HS-SPME-GCMS）进行定性定量分析[7]；发酵力、总酸和总酯测定方法参照沈怡方主编的《白酒生产技术全书》。

2 结果与讨论

2.1 酵母菌的分离、纯化和鉴定

2.1.1 酵母菌的分离、纯化

利用麦芽汁琼脂培养基从大曲和酒醅进行分离，共筛选到29株酵母菌。进一步利用麦芽汁液体结合麸曲固态培养进行筛选，以发酵产酯能力和淀粉出酒率为指标（见表1），共筛选出11株酵母，用于芝麻香酵母复合曲的生产。

表1 11株酵母产酯和出酒能力

2.1.2 酵母菌的鉴定

酵母的鉴定主要依据菌落形态，同时结合生理生化特性。依据上述特征初步分离得到的酵母菌分为4个属，分别为酿酒酵母属（Saccharomyces spp.）、假丝酵母属（Candida spp.）、毕赤酵母属（Pichia spp.）和汉逊氏酵母属（Hansenula spp.）。图1和图2为酵母菌群落和显微镜下的照片。

图1 部分酵母菌群落形态图

图2 部分酵母菌形态显微镜图片

2.2 酵母菌液态培养感官特征和理化特性

11株酵母菌以麦芽汁液体培养基，经过多次发酵试验，发酵液表面会形成白色膜，感官检查结合闻香，可闻到甜味，类似香蕉和苹果等的水果香味，有的略带酸味等其他气味，但每株酵母的产香又有区别。11株酵母感官特征见表2。

表2 11株酵母感官特征

同时，各酵母菌产酒精和产酯能力也不同（见表3）。将11株酵母等比进行混合，制备酵母麸曲，可有效提高芝麻香曲的发酵力以及酯化力。结合OD值法，酵母在经过2～3 h延滞期后迅速进入对数期，9 h后进入稳定期。

2.3 功能性酵母菌固态发酵风味物质定性分析

通过纯种液态培养功能性酵母菌种子液，然后接种到固态麸皮培养基中进行单菌种固态发酵，研究单个酵母菌风味物质形成情况；运用顶空固相微萃取-气质联用的方法进行定性分析。

酵母在风味物质数量和种类上较少，风味物质数量最多的是4#菌。其中5#酵母产β-苯乙醇含量最，高达到了24.67×10-10g/g，愈创木酚含量最高的是4#酵母，达到了98.43×10-10g/g，并且高级醇及高级脂肪酸酯含量较为丰富。

表3 11株酵母其他理化特征

表4 11株酵母菌部分风味物质 (×10-10g/g)

2.4 酵母菌固态培养条件的研究

根据上述的研究，将11株酵母菌等比进行混合，采用单因素法对影响芝麻香酵母曲的培养条件进行研究。

2.4.1 水分的影响

将培养好的11株酵母菌混合菌液，按照10%接种量接种于麸皮固态培养基上，培养36 h，考察麸皮水分对酵母菌曲的影响。

水分对发酵力和菌体浓度的影响见图3。由图3可知，随着麸皮水分的增加，酵母发酵力和菌体数量级呈先上升后下降趋势；当水分达到53%时，发酵力和菌体数量级均达到了最大值，结合生产实际经验，确定酵母曲培养麸皮水分为53%。

图3 水分对发酵力和菌体浓度的影响

2.4.2 pH值的影响

将培养好的11株酵母菌混合菌液，按照10%接种量接种于含水53%的麸皮培养基上，培养36 h，考察pH值对细菌曲的影响。pH值对酵母发酵力和菌体浓度的影响见图4。

由图4可知，随着物料pH值的上升，酵母发酵力和菌体数量呈现数量级上升趋势；当入盘pH5.0时，发酵力和菌体数量级均达到了最大值，确定了酵母曲培养最适pH值为5.0。

2.4.3 培养温度的影响

将11株酵母菌混合菌液，按照10%接种量接种于含水53%的麸皮培养基上，培养36 h,考察培养温度对酵母菌曲的影响。培养温度对酵母发酵力和菌体浓度的影响见图5。

由图5可知，随着培养温度的上升，酵母发酵力和菌体数量级均呈现上升趋势，当培养温度为28～32℃时，发酵力和菌体数量级变化不明显，此次培养温度试验和酵母理论最适培养温度吻合。

图4 pH值对发酵力和菌体浓度的影响

图5 温度对发酵力和菌体浓度的影响

2.4.4 培养时间的影响

将11株酵母菌混合菌液，按照10%接种量接种于含水53%的麸皮培养基上，培养温度32℃,进行培养，考察培养时间对酵母菌曲的影响。培养时间对酵母发酵力和菌体浓度的影响见图6。

由图6可知，随着培养时间的延长，酵母发酵

力和菌体数量级呈现上升趋势；当培养时间为36 h时，发酵力和菌体数量级均达到了顶峰，随着时间的延长，酵母菌浓度保持一定数量级，但是发酵力下滑。

图6 培养时间对发酵力和菌体浓度的影响

3 结论

3.1 利用麦芽汁琼脂培养基通过初筛得到29株酵母菌，进一步利用麦芽汁液体结合麸曲固态培养进行筛选，通过测定发酵产酯能力和淀粉出酒率共筛选出11株酵母菌，用于芝麻香酵母复合曲的生产；同时结合生理生化特征初步鉴定，分离得到酵母菌4个属：酿酒酵母属（Saccharomyces spp.）、假丝酵母属（Candida spp.）、毕赤酵母属（Pichia spp.）和汉逊氏酵母属（Hansenula spp.）。

3.2 对11株酵母菌的固态发酵风味物质进行了分析。酵母在风味物质数量和种类上较少，风味物质数量最多的是4#菌。其中5#酵母β-苯乙醇含量最高，为24.67×10-10g/g，愈创木酚含量最高的是4#酵母，为98.43×10-10g/g，并且高级醇及高级脂肪酸酯含量较为丰富。

3.3 确定了11株酵母菌等比混合下单因素固态培养的条件：酵母菌曲的最适培养条件为水分53%，pH5.0，培养温度32℃，培养时间36 h。

[1] 张应莲,钟方达,胡峰,等.贵州特色芝麻香型白酒工艺特点及成分分析[J].酿酒科技,2013(12)：13-16.

[2] 沈怡方.白酒生产技术全书[M].北京：中国轻工业出版社,2007.

[3] 王瑞明.芝麻香型白酒生产关键微生物的功能分析[D].淄博：山东轻工业学院,2011

[4] 王耀,张聪芝,李浩,等.绵柔型白酒酿造用复合功能曲多微体系分析研究[J].酿酒科技,2015(4)：41-45.

[5] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社, 1979.

[6] 黄静娟.微生物分类学[M].上海：复旦大学出版社, 1990.

[7] 张春林,敖宗华,炊伟强,等.顶空固相微萃取-气质联用快速测定大曲中的挥发性风味成分[J].食品科学, 2011,32(10)：137-140.

Preliminary Research on Functional Yeast Strains in Zhimaxiang Qu

ZHANG Longyun,ZHANG Congzhi,LI Yanrong and PU Chun
（Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian,Jiangsu 223800,China）

In the experiment,29 yeast strains were isolated from fermented grains,Daqu and liquor-making environment with dilution method,and 11 yeast strains among them were further screened out for the research.The equal mixture of the 11 yeast strains was used in the production of Zhimaxiang Qu and the optimum fermenting conditions were determined as follows:moisture content was 53%,pH5.0,fermenting temperature was at 32℃,and fermenting time was 36 h.

Zhimaxiang Qu;functional yeast strains;equal mixture

TS261.1；TQ925.7；TS262.3

A

1001-9286（2017）06-0044-05

10.13746/j.njkj.2017060

2017-03-16

张龙云（1982-），黑龙江省人，硕士，工程师，主要从事功能微生物研究工作。

优先数字出版时间：2017-05-03；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170503.1032.002.html。