金银花炒炭前后6种成分的含量变化研究Δ

吴明侠，李 会，崔永霞，侯珊珊，丁亚慧（河南中医药大学分析测试中心，郑州 450046）

金银花炒炭前后6种成分的含量变化研究Δ

吴明侠＊，李 会，崔永霞#，侯珊珊，丁亚慧（河南中医药大学分析测试中心，郑州 450046）

目的：建立同时测定金银花中6种成分含量的方法，并研究金银花炒炭前后上述成分含量的变化。方法：采用超高效液相色谱法。色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18RRHD，流动相为0.1%磷酸溶液-乙腈（梯度洗脱），流速为0.2m L/m in，检测波长为350 nm，柱温为25℃，进样量为1µL。结果：绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C检测进样量线性范围分别为21.2～424µg（r＝0.999 3）、1.17～23µg（r＝0.999 5）、2.18～43µg（r＝0.999 8）、5.10～102µg（r＝0.999 3）、2.60～52µg（r＝0.999 1）、4.95～99µg（r＝0.999 8）；精密性、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率分别为97.11%～99.76%（RSD＝1.20%，n＝6）、95.20%～99.90%（RSD＝2.20%，n＝6）、95.71%～100.30%（RSD＝2.20%，n＝6）、95.00%～96.98%（RSD＝0.88%，n＝6）、96.47%～103.00%（RSD＝2.40%，n＝6）、95.78%～103.80%（RSD＝3.20%，n＝6）。与炮制前比较，炮制后的金银花中芦丁、异绿原酸B、异绿原酸C的含量增加，绿原酸、异绿原酸A的含量明显下降，而木犀草苷的含量无明显变化。结论：该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于金银花中6种成分含量的同时测定；金银花炒炭前后化学成分有一定变化。

金银花；炒炭；超高效液相色谱法；含量；变化

金银花炭收载于1990年版《中国药典》、1988年版《全国中药炮制规范》及各省炮制规范。金银花炒炭后寒性减弱，并具涩性，有止血作用，多用于血痢、崩漏，亦可用于吐血、衄血[1]。目前，国内外对金银花药材的化学成分、药理活性及作用机制研究较多[2-5]，而对金银花炭止血机制研究尚不深入[6-8]。本课题组从金银花炒炭前后多种化学成分变化来分析其炮制机制，旨在为从药效学、药理学的角度研究金银花炭的止血机制提供理论基础。

1 材料

1.1 仪器

1290型超高效液相色谱仪，包括1260DAD检测器（美国Agilent公司）；JP-1500B-8型高速多功能粉碎机（永康市久品工贸有限公司）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率：300W，频率：70 kHz）；XS105DU型十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；FA2004B型万分之一电子分析天平（上海精科天美科学仪器有限公司）。

1.2 试剂

绿原酸对照品（批号：110753-200212）、芦丁对照品（批号：110080-200306）、木犀草苷对照品（批号：111520-200201）均购自中国食品药品检定研究院，纯度均＞98%；异绿原酸A对照品（批号：MUST-09061601）、异绿原酸B对照品（批号：MUST-09061602）、异绿原酸C对照品（批号：MUST-09041001）均购自成都曼思特生物科技有限公司，以上对照品纯度均＞98%；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

金银花药材购于河南中医药大学第三附属医院，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为真品；金银花炭是在河南中医药大学炮制学科石延榜高级实验师指导下炒制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD（50mm×2.1 mm，1.8µm）；流动相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～2 m in，15%B；2～2.5 m in，15%→18%B；2.5～8min，18%B）；流速：0.2m L/min；检测波长：350 nm；柱温：25℃；进样量：1µL[9]。色谱见图1。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取待测成分对照品各适量，加甲醇溶解制成绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C质量浓度分别为106.00、5.86、10.90、25.50、13.00、24.75µg/m L的混合对照品溶液。

2.3 金银花炭样品的制备

取金银花药材适量，共3份，每份约200 g，分别置于炒锅中，炒制温度为270℃，炒制时间为8.5min，炒至外焦褐色内焦黄色，取出，晾干，即得。

2.4 供试品溶液的制备

取金银花药材及其炭品粉末（过4号筛）各约0.25 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇30m L，超声处理45m in，称定质量，加70%乙醇补足减失的质量，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

图1 超高效液相色谱图Fig 1 UPLC chromatograms

2.5 线性关系考察

分别精密量取“2.2”项下混合对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程与线性范围，详见表1。

表1 回归方程与线性范围Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.6 精密度试验

取“2.2”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C峰面积的RSD分别为0.28%、0.47%、0.83%、1.01%、0.74%、0.66%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.4”项下金银花炭供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C峰面积的RSD分别为0.33%、0.51%、0.79%、0.85%、0.46%、0.53%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

精密称取同一批金银花炭样品适量，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C峰面积的RSD分别为0.95%、1.07%、1.22%、1.56%、1.37%、1.78%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量金银花炭样品适量，共6份，分别加入一定质量的待测成分对照品，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Resultsof recovery test（n＝6）

2.10 样品含量测定

取样品各适量，分别按“2.4”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 3 Resultsof contentdetermination of samples（n＝3，mg/g）

3 讨论

通过炮制前后化学成分的变化发现，金银花经炒炭后，增加的主要成分有芦丁、异绿原酸B、异绿原酸C，而绿原酸和异绿原酸A的含量明显下降，木犀草苷的含量变化不明显。分析各成分含量变化的原因，可能是绿原酸和异绿原酸类化合物结构不稳定，随着炮制时间延长及炮制温度改变其结构发生改变，加热后一部分转化成异绿原酸B、C，一部分结构分解破坏，总绿原酸类成分含量呈现下降趋势。但金银花炮制前后这6种成分含量的变化，是否与金银花炒炭后止血作用增强、抑菌能力下降等药理活性改变有关，仍有待进一步的试验验证。

[1] 孙赫.金银花药性与临床应用的文献研究及系统性评价[D].长沙：湖南中医药大学，2015.

[2] 宋亚玲，倪付勇，赵祎武，等.金银花化学成分研究进展[J].中草药，2014，45（24）：3656-3664.

[3] 庄丽，张超，阿里穆斯.金银花的药理作用与临床应用研究进展[J].辽宁中医杂志，2013，40（2）：378-381.

[4] 罗时旋，赵稷，张宇，等.代谢组学法考察金银花醇提物对模型小鼠肝损伤的预防作用[J].中国药房，2015，26（22）：3109-3112.

[5] 马官英，张庆刚，钟瑞华，等.金银花总黄酮对氧化应激中肝星状细胞的保护作用[J].中国药房，2014，25（31）：2895-2897.

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[7] 黄艳英，黄敏，陆中海.金银花炮制的实验研究[J].中药材，1994，17（1）：25-26.

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Study on Content Changesof 6 Components in Lonicera japonica before and after Carbonized

WU M ingxia，LIHui，CU IYongxia，HOU Shanshan，DING Yahui（Center of Analysisand Testing Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China）

OBJECTIVE：To establish themethod for simultaneous determination of 6 components in Lonicera japonica，and to study the content changes of them before and after before and after carbonized.METHODS：UPLCmethod was adopted.The determ ination was performed on Agilent Eclipse Plus C18RRHD column w ith mobile phase consisting of 0.1%phosphoric acid solutionacetonitrile（gradient elution）at the flow rate of 0.2 m L/m in.The detection wavelength was set at 350 nm，and column temperaturewas 25℃.The sample size was 1µL.RESULTS：The linear ranges of chlorogenic acid，rutin，galuteolin，isochlorogenic acid A，isochlorogenic acid B and isochlorogenic acid C were 21.2-424µg（r＝0.999 3），1.17-23µg（r＝0.999 5），2.18-43µg（r＝0.999 8），5.10-102µg（r＝0.999 3），2.60-52µg（r＝0.999 1），4.95-99µg（r＝0.999 8），respectively.RSDs of precision，stability and repeatability tests were all lower than 2.0%.Recoveries were 97.11%-99.76%（RSD＝1.20%，n＝6），95.20%-99.90%（RSD＝2.20%，n＝6），95.71%-100.30%（RSD＝2.20%，n＝6），95.00%-96.98%（RSD＝0.88%，n＝6），96.47%-103.00%（RSD＝2.40%，n＝6），95.78%-103.80%（RSD＝3.20%，n＝6）.Compared w ith before processing，the contents of rutin，isochlorogenic acid B and isochlorogenic acid C in L.japonica were increased along w ith processing，the contents of chlorogenic acid and isochlorogenic acid A were decreased significantly，while the content of galuteolin had no significant change.CONCLUSIONS：Themethod is simple，precise，stable and repeatable，and can be used for simultaneous determ ination of 6 components in L.japonica.Those chem ical components have certain changes before and after carbonized.

Lonicera japonica；Carbonize；UPLC；Content；Change

R927.2

A

1001-0408（2017）15-2112-03

2016-06-31

2016-11-03）

（编辑：张 静）

河南省高等学校重点科研项目（No.17A360022）；河南中医药大学科研苗圃工程项目（No.MP2016-17）

＊副教授。研究方向：中药质量控制和新药研发。E-mail：mxwu711@163.com

#通信作者：副教授。研究方向：中药质量控制和新药研发。E-mail：1020076356@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.27