GPP34激活结肠癌细胞Wnt信号通路促进癌细胞增殖的研究*

汪明振，邱成志，余外市，王春晓，郭延塔

（福建医科大学附属第二医院 普外科，福建 泉州 362000）

GPP34激活结肠癌细胞Wnt信号通路促进癌细胞增殖的研究*

汪明振，邱成志，余外市，王春晓，郭延塔

（福建医科大学附属第二医院 普外科，福建 泉州 362000）

目的 探讨人结肠癌细胞中高尔基相关蛋白34（GPP34）基因高表达，激活经典Wnt信号通路，促进癌细胞增殖的机制。方法将SW620结肠癌细胞株分为4组：对照组、siRNA转染组、Tricinbine组及TWS119组，分别培养；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测结肠癌细胞转染后的沉默效果；分别用Topflash报告基因活性法、噻唑蓝（MTT）、流式细胞技术检测各组癌细胞Wnt信号通路活性、生长抑制率、细胞凋亡率；Western blot检测各组结肠癌细胞中GPP34、β-catenin、pS9-糖原合酶激酶-3β（pS9-GSK-3β）蛋白的表达。结果转染siRNA后，沉默结肠癌细胞GPP34表达效果佳；与对照组比较，各实验组癌细胞的生长抑制率和凋亡率升高，且Wnt信号通路活性抑制。Western blot检测结果显示，siRNA-GPP34组GPP34蛋白表达下降，其余两组GPP34蛋白表达比较，差异无统计学意义；siRNA转染组、Tricinbine组和TWS119组的β-catenin和pS9-GSK3β蛋白表达降低。结论SW620结肠癌细胞中GPP34基因的高表达可通过激活经典Wnt细胞信号通路，促进癌细胞增殖并抑制其凋亡。

人结肠癌细胞；高尔基相关蛋白34；Wnt信号通路；增殖；糖原合酶激酶-3β；β-catenin

1 材料与方法

1.1 主要试剂

siRNA靶向GPP34（GCUUGCUUAAUCATGGTT AT）由上海吉玛公司设计合成，逆转录酶购于立陶宛Fermentus公司，SYBR Ex Taq试剂盒购于日本TaKaRa公司。噻唑蓝[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、Tricinbine购于美国Sigma公司，Annexin-V检测试剂盒购于美国Becton Dickinson公司，萤火虫荧光素酶底物及海肾荧光素酶底物购于南京碧云天公司，TWS119购于美国Santa cruz公司，兔抗人GPP34多克隆抗体购于英国Abcam公司，兔抗人pS9-糖原合酶激酶-3β（pS9-glycogen synthasc kinase-3β，pS9-GSK-3β）单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司，β-catenin、β-actin、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体购于美国Santa cruz公司。

1.2 细胞系及细胞培养

人结肠癌细胞株SW620购于中科院上海细胞所。将人结肠癌细胞SW620培养在RPMI Medium 1640+10%胎牛血清（fetal calf serum，FBS）培养基中，置于37℃、5%二氧化碳CO2+95%空气的饱和湿度环境的细胞培养箱进行培养。

1.3 方法

1.3.1 实验分组 将结肠癌细胞株SW620进行实验分组，接种细胞于6孔板，并将其分为4组：对照组 [等量磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）]、siRNA转染组（转染组采用脂质体法，参照说明书用50 nmol siRNA转染SW620细胞）、Tricinbine组（加 Akt抑制剂 50 nmol）、TWS119组（加GSK-3β抑制剂50 nmol），继续培养各组细胞。

1.3.2 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测转染组沉默效果 用Trizol裂解法提取转染组结肠癌细胞株总RNA，将RNA逆转录为cDNA，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参，进行RT-PCR反应。反应条件：95℃预变性 20 s；95℃变性 10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸20 s，共循环45次，在退火阶段检测荧光；熔解曲线条件为50℃预热15 s，51℃升温至99℃，每升高1℃停留5 s。GPP34正向引物：5'-AGGGCGA CTCCAAGGAAA-3'；反向引物：5'-TGATGTGTAACC CTCGCG-3'，产物长度83 bp；聚合酶链反应引物由上海吉玛公司所设计，使用GAPDH作为内参，数据分析通过相对定量ΔCt法进行。

当学生面对问题束手无策时，教师要采取有效的方式，激活学生已有的数学活动经验，使学生的学习基于经验而又超越经验，完善数学活动经验。

1.3.3 Topflash报告基因活性法检测Wnt信号通路活性 弃培养液，用PBS缓冲液洗1次，加入100 μl Harvest buffer作用10 min后裂解细胞，轻轻吸取其中40 μl置于离心管中，加入20 μl萤火虫荧光素酶底物或海肾荧光素酶底物。涡旋混匀后即刻用光度计检测每孔中萤火虫荧光值及海肾荧光值，两者的比值 [相对光单位值（relative luminescence units value，RLU）]即指示细胞内Wnt信号通路中核内转录因子 T 细胞因子（T cell factor，TCF）/淋巴样增强因子（lymphoid enhancing factor，LEF）的激活水平。

1.3.4 MTT法检测各组SW620结肠癌细胞的生长抑制率 各组细胞经胰酶消化后，接种于96孔板，加100 μl（1×105个细胞）/孔，贴壁培养24 h后，每组设4个复孔及对照孔，对照孔仅加入细胞不做处理。培养 48 h后，加5 mg/ml MTT 10 μl/孔培养 4 h，弃培养液。每孔加二甲基亚砜（Dimethyl Sulphoxide，DMSO）150 μl，避光振荡混匀，结晶溶解后用酶标仪检测波长490 nm吸光度A值。计算公式：癌细胞生长抑制率=（1-处理组平均光密度（optical delnsity，OD）490值/对照组平均OD490值）×100%。

1.3.5 流式细胞技术Annexin V-FITC/PI法检测各组细胞株的凋亡率 重悬各组细胞后取5～10万重悬的沉淀细胞，加入200 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入10 μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温避光孵育10～20 min，置于冰浴中。随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶为红色荧光。

1.3.6 Western blot检测各组蛋白表达 收集处于对数生长期的各组细胞进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）电泳，然后湿转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，封闭60 min后分别加入一抗GPP34、pS9-GSK-3β、βcatenin、β-actin，4℃孵育过夜；三羟甲基氨基磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline and tween 20，PBST）漂洗20 min/次，共3次；加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗溶液，室温孵育1h；PBST漂洗10 min/次，共3次；增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂检测。图像应用Image J软件进行灰度分析，目的蛋白表达的相对强度=目的条带的灰度值/β-actin条带的灰度值。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，各实验组与对照组比较用Dunnett-t检验，实验组两两比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SW620结肠癌细胞siRNA转染效果

SW620结肠癌细胞培养良好，对照组GPP34 mRNA的相对表达量为（1.000±0.092），siRNA转染组GPP34 mRNA的相对表达量为（0.236±0.076），经t检验，差异有统计学意义（t=5.57，P=0.005）。转染组GPP34 mRNA的相对表达量低于对照组，转染效果佳。见图1。

图1 SW620结肠癌细胞 （×100）

2.2 各组癌细胞Wnt信号通路的活性

对照组、siRNA转染组、Tricinbine组及TWS119组SW620癌细胞的相对荧光素酶活性，即RLU值分别为（1.000±0.164） 与（0.342±0.061）、（0.359±0.125）和（0.365±0.155）。各组 RLU 值比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=17.812，P=0.001）。各实验组分别与对照组比较，经Dunnett-t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），各实验组RLU值低于对照组，表明抑制GSK-3β、Akt活性及沉默GPP34均可降低SW620结肠癌细胞的Wnt信号通道活性，且各实验组间RLU值两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 2。

图2 各组SW620结肠癌细胞的Wnt信号通路活性比较（±s）

2.3 各组SW620结肠癌细胞生长抑制率比较

MTT法检测显示，对照组、siRNA转染组、Tricinbine组及TWS119组的癌细胞相对OD490值分别为 （1.000±0.147）、（0.401±0.010）、（0.434±0.116）和（0.487±0.077），siRNA 转染组、Tricinbine组及TWS119组生长抑制率分别为59.9%、56.6%和51.3%。各组生长抑制率比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=13.101，P=0.002）。各实验组分别与对照组比较，经Dunnett-t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），各实验组生长抑制率低于对照组，说明抑制GSK-3β、Akt活性及沉默GPP34均可抑制SW620结肠癌细胞增殖。各实验组间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 各组SW620结肠癌细胞相对OD490值比较（±s）

2.4 各组SW620结肠癌细胞凋亡率比较

流式细胞仪Annexin V法检测各组细胞的凋亡率，对照组、siRNA转染组、Tricinbine组及TWS119组SW620癌细胞的凋亡率分别为（1.680±0.576）%、（52.467±4.373）%、（46.167±5.293）%和（50.167±6.506）%。各组凋亡率比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=77.610，P=0.000）。各实验组分别与对照组比较，经Dunnett-t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），各实验组癌细胞的凋亡率较对照组提高，提示抑制GSK-3β、Akt活性及沉默GPP34均可促进癌细胞凋亡。且各实验组间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 4、5。

图4 各组SW620结肠癌细胞的凋亡情况

图5 各组SW620结肠癌细胞凋亡率比较

2.5 β-catenin、pS9-GSK-3β及 GPP34蛋白的表达

各组的 GPP34、pS9-GSK-3β、β-catenin蛋白相对表达量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=125.479、22.787 和 132.135，均P=0.000）。各实验组蛋白相对表达量与对照组比较，经Dunnett-t检验结果：①在GPP34蛋白检测中，siRNA-GPP34组与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），siRNA转染组的GPP34蛋白相对表达量低于对照组；其余两组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），沉默效果良好；②3个实验组中β-catenin和pS9-GSK-3β蛋白相对表达量分别与对照组比较，差异无统计学意义（P＜0.05）。各实验组间蛋白相对表达量两两比较，经SNK-q检验结果：①GPP34蛋白：Tricinbine组、TWS119组与siRNA-GPP34组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），而 Tricinbine组与 TWS119组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；②β-catenin蛋白：siRNA-GPP34组、Tricinbine组与TWS119组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），而 siRNA-GPP34组与Tricinbine组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；③pS9-GSK-3β蛋白表达在各实验组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见附表和图 6、7。

附表 各组蛋白的相对表达量比较 （±s）

附表 各组蛋白的相对表达量比较 （±s）

注：t1、P1：对照组 vs siRNA 转染组；t2、P2：对照组 vs Tricinbine 组；t3、P3：对照组 vs TWS119 组；q1：Tricinbine组 vs TWS119 组；q2：siRNA转染组 vs TWS119组；q3：siRNA转染组 vs Tricinbine组

组别β-catenin对照组 1.000±0.015 1.000±0.194 1.000±0.088 siRNA转染组 0.260±0.008 0.280±0.043 0.182±0.010 Tricinbine组 0.906±0.006 0.208±0.065 0.192±0.073 TWS119组 0.983±0.078 0.371±0.160 0.362±0.018 t1值 73.138 2.272 0.316P1值 0.000 0.053 0.762 t2值 6.272 6.703 4.324P2值 0.003 0.003 0.012 t3值 16.006 12.210 12.313P3值 0.000 0.000 0.000 q1值 1.491 1.948 32.553 q2值 14.151 1.080 32.842 q3值 12.655 0.872 0.289 GPP34pS9-GSK-3β

图6 GPP34、pS9-GSK-3β及β-catenin蛋白的表达

图7 各实验组GPP34、pS9-GSK-3β及β-catenin蛋白相对表达量比较

3 讨论

近来研究表明，GPP34基因可促进癌细胞的生长、增殖并抑制凋亡，是一种新的原癌基因[6-7]。在胃癌[8]、肝癌等[9]多种癌组织中存在GPP34表达明显上调，且与细胞分化差、淋巴结转移、分期晚、恶性程度高呈正相关。目前研究表明，GPP34高表达可通过雷帕霉素靶蛋白的复合体（mammalian target of rapamycin complex，mTORC）1 和 mTORC2底物磷酸化激活mTOR信号通路，加速细胞增殖分裂[7]，但是否存在激活其它细胞内信号通路，未见文献报道。因此，在笔者前期研究基础上，采用沉默GPP34基因方法进一步探讨GPP34高表达激活经典Wnt信号通路的机制。

经典Wnt信号通路激活后可抑制降解复合体（由GSK-3β、结直肠腺瘤性息肉蛋白、轴蛋白等蛋白组成）中关键活性成分GSK-3β的磷酸化，使βcatenin避免被泛素蛋白酶体识别和降解，并与转录因子TCF/LEF结合而导致细胞增殖的异常，促进肿瘤的发生、发展[10-11]。已有研究证实，结肠癌等肿瘤细胞中Wnt信号通路存在过度激活，且与肿瘤的发生、发展关系密切，可能成为结肠癌的防治的新途径[12-13]。本实验首次显示沉默GPP34基因表达可降低经典Wnt信号通路活性，提示GPP34的高表达可激活SW620结肠癌细胞经典Wnt信号通路，促进细胞增殖并抑制凋亡。

GPP34高表达可增强表皮生长因子引起的核糖体S6激酶表达水平升高，同时可通过Ser473磷酸化激活Akt，Akt激活后的作用底物包括mTOR和GSK-3β等，GSK-3β是经典Wnt信号通路的关键调节因子，其磷酸化后可通过对β-catenin的影响参与细胞增殖、凋亡的调控[14]。本实验显示，沉默GPP34基因表达、阻断Akt或GSK-3β位点后β-catenin和pS9-GSK-3β蛋白表达均降低，SW620结肠癌细胞增殖和Wnt信号通路活性受到抑制，细胞凋亡增加，提示GPP34的高表达可上调pS9-GSK-3β和βcatenin蛋白表达，因此笔者推断GPP34高表达可通过Akt/GSK-3β激活Wnt信号通路，促进结肠癌细胞的增殖。

综上所述，SW620结肠癌细胞中GPP34基因的高表达可激活经典Wnt细胞信号通路促进癌细胞增殖，抑制凋亡，其机制可能是通过激活Akt，进一步通过GSK-3β介导Wnt细胞信号通路的激活。GPP34可作为结肠癌靶向治疗的潜在新靶点。

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（童颖丹 编辑）

GPP34 promotes colon cancer cell proliferation through activation of Wnt signaling pathway*

Ming-zhen Wang,Cheng-zhi Qiu,Wai-shi Yu,Chun-xiao Wang,Yan-ta Guo
(Department of General Surgery,the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Quanzhou,Fujian 362000,China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of high-expression of Golgi-associated protein of 34(GPP34)gene in activation of Wnt signaling pathway to promote colon cancer cell proliferation.Methods Colon cancer cell lines were divided into four groups:control group,siRNA transfection group,the group of added inhibitor of Akt/Protein Kinase B (Tricinbine group),and the group of added inhibitor of GSK-3β(TWS119 group).The cells were cultured respectively.The silencing effect ofGPP34gene was detected by RT-PCR.The proliferation and apoptosis of the cancer cells in all groups were detected by MTT and flow cytometry respectively.Topflash reporter gene activity assay was used to detect the activity of Wnt signaling pathway in the cancer cells of each group.The expressions of GPP34,β-catenin and pS9-GSK-3β proteins in the cancer cells of all groups were detected by Western blot.ResultsThe expression level ofGPP34mRNA in the transfection group was significantly lower than that in the control group (P＜0.05).Compared to the control group,the growth inhibition rate and the apoptosis rate were significantly increased(P＜0.05),and the activity of Wnt signaling pathway was significantly inhibited in each experimental group (P＜0.05).However,the growth inhibition rate,the apoptosis rate and the activity of Wnt signaling pathway showed no significant differences among the experimental groups(P＞0.05).Compared to the control group,GPP34 protein expressionsignificantly decreased in the siRNA transfection group (P＜0.05),while that in the other two experimental groups had no significant difference(P＞0.05);β-catenin and pS9-GSK-3β protein expressions were significantly decreased in the three experimental groups(P＜0.05).ConclusionsHigh-expression of GPP34 can activate the classical Wnt signaling pathway to promote proliferation and inhibit apoptosis of SW620 colon cancer cells.

human colorectal cancer cell line;GPP34;Wnt signaling pathway;proliferation;glycogen synthase kinase-3β;β-catenin

R735.35

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.003

1005-8982（2017）12-0015-06

2016-08-18

福建省自然科学基金（No：2015J01438）；福建医科大学校教授基金（No：JS14028）

邱成志，E-mail：qchengzhi@sohu.com