3株真核微藻在不同浓度猪粪水沼液中生长差异及氮磷去除率研究

王利燕，黄开耀，彭 霞，桑奥闻，徐泽东，蒋思文,5*，高其双*

（1.华中农业大学动物科技学院，湖北武汉 430070；2.中国科学院水生生物研究所藻类生物学重点实验室，湖北武汉 430072；3.武汉市农业科学技术研究院畜牧兽医科学研究所，湖北武汉 430208；4.武汉净宇微藻科技有限公司，湖北武汉 430074；5.湖北省生猪健康养殖协同创新中心，湖北武汉 430070）

3株真核微藻在不同浓度猪粪水沼液中生长差异及氮磷去除率研究

王利燕1，黄开耀2，彭 霞3，桑奥闻1，徐泽东4，蒋思文1,5*，高其双3*

（1.华中农业大学动物科技学院，湖北武汉 430070；2.中国科学院水生生物研究所藻类生物学重点实验室，湖北武汉 430072；3.武汉市农业科学技术研究院畜牧兽医科学研究所，湖北武汉 430208；4.武汉净宇微藻科技有限公司，湖北武汉 430074；5.湖北省生猪健康养殖协同创新中心，湖北武汉 430070）

为比较小球藻（Chlorella Vulgaris）、四尾栅藻（Scenedesmus Quadricauda）和斜生栅藻（Scenedesmus Obliqnus）3株真菌微藻在不同浓度猪粪水沼液中的生长情况及氮磷去除率的差异，试验选用猪粪水沼液，进行稀释，得到1/1、1/2、1/4、1/8、1/16和1/32不同浓度的猪粪水沼液，高压灭菌后，分别培养3株微藻。结果表明：3株微藻均能在粪水沼液中生长，而且能有效去除浓度为1/4、1/8、1/16和1/32的沼液中的氮磷；在浓度为1/4和1/8沼液中，小球藻相对生长速率最高，而在浓度为1/16和1/32的沼液中，四尾栅藻和斜生栅藻的生长速率优于小球藻；在浓度为1/4、1/8、1/16和1/32的沼液中，斜生栅藻的总氮和氨态氮去除效果最佳；3株微藻在浓度为1/4和1/8的沼液中硝态氮增加，在1/16和1/32沼液硝态氮有所减少，其中四尾栅藻去除效果较好；四尾栅藻和斜生栅藻的总磷去除率基本相同，优于小球藻。在本试验条件下，小球藻和斜生栅藻可作为后期驯化的优势藻种。

微藻；猪粪水沼液；生长差异；总氮；总磷

随着畜牧业的不断发展，畜禽养殖粪污污染问题逐渐引起社会关注，因此寻找简单、低成本、低投入、效果好的粪水处理工艺成为畜牧业可持续发展的关键。目前，研究者们尝试运用藻类处理各种养殖粪水，此方法具有局限性小、占地面积小、微藻生长速度较快、能吸收较多的氮磷、净化效率高等特点[1-2]。已有报道指出，利用养殖粪水培养小球藻，粪水中总氮、总磷和氨态氮的去除率分别达50%、60%和90%以上[3]。程海翔[4]研究表明，养猪粪水培养栅藻，粪水中氨态氮、总氮和总磷的去除率分别为97.3%、87.9%和93.2%。虽然研究者们在此方面开展了大量研究工作，但对于不同浓度的猪粪水沼液对藻类生长的影响及氮磷去除率的研究较少。将藻类用于规模化去除沼液中的富营养元素，沼液浓度越低意味着成本越高。因此，本试验选用小球藻（Chlorella Vulgaris）、四尾栅藻（Scenedesmus Quadricauda）和斜生栅藻（Scenedesmus Obliqnus）3株去除污水较好的微藻分别培养于不同浓度猪粪水沼液中，分析3株微藻的生长差异及氮磷去除率，为今后培养微藻选择最适宜的粪水沼液浓度及规模化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验藻株 小球藻HS108来自于武汉净宇微藻科技有限公司，四尾栅藻FACHB-1297和斜生栅藻FACHB-276来自于中科院淡水藻种库。

1.1.2 试验沼液 猪粪水沼液取自新洲东泰畜牧有限公司，首先将粪水沼液3 000 r/min离心20 min，然后用纯水将猪粪水沼液稀释成1/1、1/2、1/4、1/8、1/16和1/32等6种浓度，121℃高压灭菌20 min表1所示。试验粪水沼液稀释前的水质状况。

表1 试验用猪粪水沼液稀释前的水质状况 mg/L

1.2 试验方法

1.2.1 藻种接种及培养 3株微藻在BG11培养基（表2）中扩培，待各微藻在680 nm处的光密度值（OD680）为0.900左右时，离心收集藻细胞，将藻细胞分别接种到高压灭菌后的不同浓度猪粪水沼液中，并用纯水和BG11作对照。接种比例为1:10，接种好的微藻于（27±1）℃培养，光照强度为2 000 Lx，采用24 h光照，每2 d测定藻细胞生长状况，培养13 d后测定猪粪水沼液氮磷等去除情况。

表2 BG11（Blue-Green Medium）

1.2.2 微藻生长分析 培养液中微藻的细胞密度与其在680 nm处光密度值成线性相关[5]，因此用紫外可见分光光度计（UV754N 上海仪电分析仪器有限公司）测定活体藻液在680 nm处的光密度值代表细胞密度，根据公式（1）计算微藻接种到粪水沼液后1～13 d的相对生长速率：其中，K为相对生长速率；t1、t2为对应的培养时间；N1、N2分别为t1、t2时期的藻液的OD680值。

1.2.3 水质指标测定 水质指标总氮、总磷、氨态氮和硝态氮的测定均采用国家环境保护总局颁布的标准方法[6]。总氮用GB11894-89碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法，氨态氮用GB7479-87纳氏试剂比色法，总磷用GB11893-89钼酸铵分光光度法，硝态氮用HZ-HJ-SZ-0138紫外分光光度法。

总氮和总磷等去除率（r）计算：r=（C0-Ct）/ C0×100%

其中，C0为初始总氮总磷等浓度，Ct为培养t天后的浓度（mg/L）。

1.3 统计分析 试验数据均重复3次，用t检验进行显著性分析，结果以平均值±标准差表示，P＞0.05表示差异不显著，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 3株微藻在粪水沼液中的生长特性 如图1所示，小球藻在1/1浓度的沼液中无生长迹象，在1/2浓度的沼液中有生长趋势，但生长趋势变化较小。其余浓度的小球藻在取粪水沼液当天处于生长阶段，排序是BG11＞1/8＞1/4＞1/16＞1/32＞纯水＞1/2＞1/1。

由图2～3可知，四尾栅藻和斜生栅藻在1/1和1/2浓度的沼液中无生长迹象，其余浓度微藻在取粪水沼液当天处于生长阶段，排序分别为BG11＞1/16＞1/32＞1/8＞1/4＞纯水＞1/1＞1/2和1/8＞1/16＞BG11＞1/32＞1/4＞纯水＞1/1＞1/2。

图1 小球藻在不同浓度粪水沼液中的生长曲线

图2 四尾栅藻在不同浓度粪水沼液中的生长曲线

图3 斜生栅藻在不同浓度粪水沼液中的生长曲线

2.2 3株微藻在粪水沼液中的相对生长速率 如表3所示，经纯水、BG11、1/4、1/8、1/16和1/32沼液培养13 d后，小球藻的相对生长速率分别为0.113、0.239、0.198、0.209、0.210、0.150，四尾栅藻的相对生长速率为0.094、0.188、0.101、0.138、0.212、0.168，斜生栅藻的相对生长速率为0.101、0.208、 0.157、0.207、0.236、0.175。可以看出，在1/4浓度沼液中，小球藻的相对生长速率极显著高于四尾栅藻和斜生栅藻（P＜0.01），同时斜生栅藻极显著高于四尾栅藻（P＜0.01）。在1/8浓度沼液中，小球藻和斜生栅藻的相对生长速率极显著高于四尾栅藻（P＜0.01），小球藻与斜生栅藻间差异不显著（P＞0.05）。在1/16浓度沼液中，斜生栅藻极显著高于小球藻和四尾栅藻（P＜0.01），但小球藻和四尾栅藻差异不显著（P＞0.05）。在1/32浓度沼液中，斜生栅藻和四尾栅藻极显著高于小球藻（P＜0.01），但斜生栅藻与四尾栅藻间差异不显著（P＞0.05）。可以得出，斜生栅藻在1/16沼液中生长最好。

表3 3种微藻在BG11培养基、纯水和不同浓度粪水沼液中的相对生长速率

2.3 3株微藻对粪水沼液中总氮、氨态氮和硝态氮的影响 如表4～5所示，斜生栅藻对不同浓度粪水沼液总氮和氨态氮的去除率均高于其余2株微藻。斜生栅藻对1/4、1/8、1/16和1/32浓度沼液总氮和氨态氮去除率分别为44%、75%、88%、92%和47%、81%、96%、93%。在1/4浓度沼液中斜生栅藻和小球藻总氮和氨态氮去除率极显著高于四尾栅藻（P＜0.01），斜生栅藻显著高于小球藻（P＜0.05）。1/8浓度沼液中斜生栅藻总氮和氨态氮的去除率极显著高于小球藻（P＜0.01），并显著高于四尾栅藻（P＜0.05），其中小球藻与四尾栅藻差异不显著（P＞0.05）。1/16浓度沼液中斜生栅藻和四尾栅藻总氮和氨态氮的去除率极显著高于小球藻（P＜0.01），斜生栅藻与四尾栅藻差异不显著（P＞0.05）。1/32浓度沼液中斜生栅藻总氮去除率极显著高于其余2株微藻（P＜0.01），四尾栅藻极显著高于小球藻（P＜0.01），但3株微藻氨态氮去除率差异不显著（P＞0.05）。如表6所示，3株微藻对1/4和1/8浓度沼液硝态氮不但无去除反而增加，1/16和1/32浓度沼液硝态氮有去除，四尾栅藻去除效果较好，去除率分别达到75%和100%。综上所述，斜生栅藻在1/16和1/32浓度沼液中总氮和氨态氮去除较好。

2.4 3株微藻对粪水沼液中总磷的影响 如表7所示，3株微藻对1/4浓度沼液总磷去除率差异不显著（P＞0.05），去除率在50%左右。四尾栅藻和斜生栅藻对1/8和1/16浓度沼液总磷去除率差异不显著（P＞0.05），且都极显著高于小球藻（P＜0.01），去除率达80%以上。3株微藻对1/32浓度沼液总磷去除率达90%以上。

3 讨 论

3.1 3株微藻在粪水沼液中的生长特性 从3株微藻在不同浓度沼液中的生长性能可以看出，3株微藻在1/1沼液中均不能生长，在1/2浓度沼液中小球藻有较小的生长趋势，其余2株微藻无生长迹象。在1/4和1/8浓度沼液中小球藻相对生长速率高于其余2株微藻。斜生栅藻在1/8浓度沼液中的相对生长速率与在BG11培养时基本相同，随后在1/16和1/32浓度沼液中斜生栅藻的相对生长速率高于小球藻。而四尾栅藻在1/16浓度沼液中的相对生长速率高于BG11培养。由此表明，小球藻在较高浓度粪水沼液中生长的耐性强于栅藻，其中四尾栅藻耐性最差。但如果3株微藻同时在适宜的粪水沼液浓度下生长时，斜生栅藻相对生长速率较高，这与很多学者报道的选用栅藻处理养殖、生活和工业污水一致[7-8]。3株微藻在1/32浓度沼液中的相对生长速率低于1/16浓度沼液，说明1/32浓度沼液中氮磷含量太低，难以满足微藻需求。

表4 3株微藻对不同浓度粪水沼液总氮的去除率 %

表5 3株微藻对不同浓度粪水沼液氨态氮的去除率 %

表6 3株微藻对不同浓度粪水沼液硝态氮的去除率 %

表7 3株微藻对不同浓度粪水沼液总磷的去除率 %

3.2 3株微藻对粪水沼液中总氮、氨态氮和硝态氮的影响 在养殖废水中，氨态氮和亚硝态氮的含量远高于硝态氮，氨态氮在养殖废水可溶性无机氮中占比可达50%～90%[9]。本试验所采用的粪水沼液氨态氮含量占总氮80%左右。本试验表明，经过斜生栅藻和四尾栅藻处理过的1/32浓度沼液，其总氮从11.27 mg/L分别降到0.91、1.97 mg/L，均达到了地表水环境质量标准（GB3838-2002）的Ⅲ类水总氮要求和Ⅴ类水总氮要求。经过斜生栅藻和四尾栅藻处理过的1/16和1/32浓度沼液的氨态氮分别为0.80、0.81 mg/L和0.77、0.97 mg/L，达到了地表水环境质量标准（GB3838-2002）的Ⅲ类水氨态氮要求。因此，斜生栅藻对不同浓度粪水沼液总氮和氨态氮去除率最高，其次是四尾栅藻。

本试验中，3株微藻对1/4和1/8浓度沼液的硝态氮去除率为负值，而对1/16和1/32浓度沼液有去除。赖子尼等[10]研究发现，氨态氮、硝态氮和亚硝态氮是藻类吸收利用的主要有效氮，其中氨态氮和硝态氮是水生植物氮营养元素的主要形态，水生植物优先利用氨态氮，当氨态氮浓度很低时才会利用硝态氮。藻类光合作用产生氧气，在硝化菌作用下会使氨态氮转化为硝态氮，进而分析，本试验1/4和1/8浓度沼液氨态氮高于1/16和1/32浓度沼液氨态氮。1/4和1/8浓度沼液氨态氮浓度还未被微藻吸收到较低水平，培养13 d后微藻还未开始吸收硝态氮。再加上沼液硝化菌将氨态氮少量转化为硝态氮，导致1/4和1/8浓度沼液硝态氮反而增加。而1/16和1/32浓度沼液中氨态氮浓度起初较低，当微藻吸收氨态氮到一定程度时开始吸收硝态氮，从而使其去除率较高，这与很多学者报道的结果一致[11]。

3.3 3株微藻对粪水沼液中总磷的影响 经过小球藻处理后的1/32浓度沼液中总磷降为0.02 mg/L，达到了地表水环境质量标准（GB3838-2002）的Ⅰ类水总磷要求。四尾栅藻处理后的1/16和1/32浓度沼液中总磷分别降为0.14 mg/L和0.13 mg/L，达到了地表水环境质量标准（GB3838-2002）的Ⅲ类水总磷要求。斜生栅藻处理后的1/8、1/16和1/32浓度沼液中总磷分别降为0.16、0.097、0.04 mg/L，均达到了地表水环境质量标准（GB3838-2002）的Ⅲ和Ⅱ类水总磷要求。

3.4 3株微藻相对生长速率与氮磷去除率关系 同一微藻的相对生长速率与氮磷去除率基本呈正比关系[12]。但不同微藻之间却不同，如在1/4浓度沼液中，小球藻的相对生长速率高于斜生栅藻，但氮磷去除率却低于斜生栅藻。斜生栅藻常由4个细胞组成，4个细胞宽12～34 μm，细胞长10～21 μm。而小球藻直径3～8 μm，小于斜生栅藻。另外，由于每种微藻的生长和代谢情况不一样，因此推测，斜生栅藻在生长阶段要达到与小球藻同样细胞浓度时对氮磷等营养元素的需求高于小球藻，从而造成1/4浓度沼液中小球藻的相对生长速率高，而氮磷等去除率低的现象。同时，也可能由于不同种藻种生长特性的差异和对氮磷去除效果不同而造成的[13]。

4 结 论

本试验利用不同浓度沼液培养3株微藻，高压灭菌沼液中的总氮、总磷、氨态氮和硝态氮分别为88.18、8.67、67.28 、7.19 mg/L时，3株微藻都能存活。相比另外2株微藻，斜生栅藻在粪水沼液氮磷去除效果和相对生长速率方面都比较好，是处理粪水沼液的一株优势藻种；高压灭菌沼液总氮、总磷、氨态氮和硝态氮分别为176.36、17.33、134.56 、14.37 mg/L时，小球藻也能存活，但生长趋势较小。说明小球藻在高浓度粪水沼液中存活耐性强于栅藻，如果将其进行驯化，将是一株更好的处理高浓度粪水沼液的优势藻种。综上，利用微藻处理养殖粪水基本可以达到水质排放标准并减轻对地表水体污染，保护生态环境，促进养殖业可持续发展，同时，藻细胞及其细胞成分具有经济价值，因此，微藻处理养殖粪水具有广阔的应用前景和意义。

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S828.5

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-098

2016-11-21；

2017-01-31

湖北省重大科技攻关项目（2014BBB015）

王利燕（1989-），女，河南濮阳人，硕士研究生，研究方向为农业推广养殖，E-mail: 935127716@qq.com

*通讯作者：蒋思文，教授，主要从事分子遗传与动物育种研究，E-mail: jiangsiwen@mail.hzau.edu.cn；高其双，高级畜牧师，主要从事循环农业研究， E-mail: 850881665@qq.com