复方君子汤诱导白血病K562细胞凋亡的机制研究

陈毅宁　梁春灵　廖斌　皇甫真萍　齐彦　陈佳薇

摘要：目的本研究探讨复方君子汤（FFJZ）对抑制白血病K562细胞生长增殖和诱导凋亡的作用机制。方法 用不同浓度复方君子汤作用于K562细胞，应用MTF法观察复方君子汤对K562细胞生长增殖的影响，AnnexinV/PT染色和流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡，Western blot检测Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表达。结果在一定浓度的复方君子汤作用后的K562细胞的增殖被抑制，随着浓度的增加及使用时间的延长，K562细胞的增殖抑制率及凋亡比例明显增加；同时，Caspase-8蛋白及FaS蛋白的表达明显上升。结论一定浓度的复方君子汤可抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡，其机制可能与上调Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表达有关。

关键词：复方君子汤；白血病；K562细胞；细胞凋亡；机制

中圖分类号：R289.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2017）03-0018-04

白血病是一种常见的恶性血液系统肿瘤，严重危害人类生命健康，细胞分化与凋亡受阻是白血病发病的重要机制之一，因此探索诱导白血病细胞凋亡的新药是目前研究白血病治疗的热点之一。中医认为白血病的发病是由于机体正气亏虚，邪毒伤髓，毒瘀互结，继而发病，治疗上当遵循益气养阴、扶正祛邪与活血化瘀三法并用之原则，复方君子汤是福建中医药大学附属人民医院经过临床实践总结而成，在急性白血病的临床治疗中取得良好疗效。为进一步研究复方君子汤抗白血病的生物学作用，笔者观察了复方君子汤对人白血病细胞K562生长的影响，并对其相关作用机制进行了探讨。现将结果报道如下。

1材料和方法

1.1主要试剂 复方君子汤（党参20 g，黄芪20 g，茯苓15 g，白术15 g，川芎10 g，浙贝母10 g，补骨脂10 g，甘草6 g等）由福建中医药大学附属人民医院中药制剂室提供。四甲基偶氮唑蓝（mehyl-thazol-tetrazolinum，MTF）购自Serva公司；胎牛血清（bovine scrtlln albumin，BSA）购自杭州四季青生物公司；台盼蓝购自Chroma公司；改良型PRMI-1640培养基为海克隆生物化学制品公司产品；二甲亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）购自北京化工厂；AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。

1.2细胞来源 人红白血病细胞株K562由河南省肿瘤医院中心实验室提供。

1.3主要仪器 倒置相差显微镜（IX71型）为日本OLYMPUS公司产品；水套式c02培养箱（CJ-1100型）为长沙长棉应用技术研究所产品；立式灭菌器（LMQ·C型）为山东新华医疗器械公司生产；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9143BS-Ⅲ型）为上海新苗医疗器械公司产品；酶标仪（Model680型）为BIORAD公司生产；净化工作台（SW-CJ-1F型）为苏净集团公司产品；流式细胞仪（Coulter EPICS型）为Beckman Coulter公司产品；高速低温离心机（Allegra TMX一12R型）为Beckman公司产品。

1.4细胞培养 K562细胞使用含10%小牛血清、链霉素及青霉素各100U/ml的nyQ改良型PRMI-1640培养液培养，置于浓度为5%，温度为37℃、湿度为100%的C02培养箱中培养，每2-3天换液1次，选取对数生长期细胞进行实验。

1.5MTF法测定细胞增殖抑制率 选取对数生长期K562细胞按2.0×10⁵/ml密度分别接种于96孔培养板，随机分为五组，分别为：①空白对照组；②As：03组：加入AS₂O₃（终浓度为3×10^-6mol/L）；③复方君子汤组：加复方君子汤（终浓度分别为2.0、6.0、10.0mg/mL），每组设8个平行复孔，置于CO₂培养箱中共同培养，分别于24 h，48 h.72 h取各组培养板，每孔加入20μlMTF（5.0，.g/mE），继续培养4 h，离心后弃上清液，加入100ulDMSO，摇匀并震荡10min，在酶标仪上读取450 nm处测吸光值。计算K562细胞增殖抑制率（%）=[1-（实验组平均吸光度/细胞对照组平均吸光度）]×100%。

1.6AnnexinV/PI双染色法和流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡 分别收集各组培养24 h，48 h，72 h后的细胞，并将其浓度调整为5.0×10⁵/mL。将细胞重悬浮于100μL结合缓冲液（10mmol/L HEPES，pH 7.4，140 nunol/L NaOH，2.5 mmnol/LCaCl₂）。加入10 uL AnnexinV和5 uL PI，轻轻混匀，4℃避光反应30分钟。再加入100μl结合缓冲液，在1小时内上机检测荧光强度，重复3次。

1.7Westem blot检测Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表达 收集经10.0mg/L的复方君子汤处理后的K562细胞2.0×10⁵/ml，经离心、PBS缓冲液洗涤，同时设立不加药物的空白对照组，用1 xNuPAGE LDS细胞裂解液（含50mmol/L二硫苏糖醇，DTF）裂解细胞后，采用考马斯亮蓝法（Coomassie Assay）测定总细胞提取液中的蛋白浓度。取30μg经SDS-PAGE电泳分离，然后转移至醋酸纤维素膜上，5%无脂牛奶封闭2h，加一抗在4℃过夜孵育，TBS缓冲液洗涤3次，二抗室温孵育2h，化学发光法检测蛋白表达。

1.8统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，两组均数之间比较采用t检验；组间比较采用单因素方差分析；计数资料采用卡方检验。

2结果

2.1MTF法测定不同浓度组的细胞增殖抑制率 2.0、6.0、10.0 mg/ml的复方君子汤分别作用于K562细胞24 h、48 h、72h后的细胞生长抑制率（表1，图1）。检测结果显示，2.0 mg/ml的复方君子汤组与空白对照组无显著差别（P>0.05），其余各浓度组K562细胞的抑制率与药物浓度及使用时间呈正相关（r=0.699），各浓度组与空白对照组相比有显著差异（P<0.01）。

2.2AnnexinV/PI检测不同浓度组的细胞凋亡率 随作用浓度的增加凋亡率也逐渐增高，2.0 mg/L的复方君子汤对K562细胞的诱导凋亡作用不明显，与空白对照组比较无统计学差异（P>0.05），而6.0mg/L的复方君子汤使K562细胞早期凋亡比例明显增高，与空白对照组比较有统计学差异（P<0.01），而浓度达到10.0 mg/L时，细胞晚期凋亡比例明显增多，与空白对照组比较有统计学差异（P<0.01）（表2）。

2.3Western blot检测Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表达

Western blot分析结果表明，6.0mg/L及10.0mg/L的复方君子汤作用72h后Caspase-8蛋白及Fas蛋白表达水平明显升高，和空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），见表3。

3讨论

复方君子汤是本科在临床实践中不断摸索总结而成的经验方，在临床运用中取得良好疗效。我科前期实验研究表明复方君子汤对恶性肿瘤化疗有明显增效减毒作用，能明显逆转白血病细胞株K562/VCR耐药性，提高耐药细胞对阿霉素的敏感性。本研究通过对复方君子汤对白血病细胞K562诱导凋亡的机制研究，以探讨复方君子汤诱导白血病细胞凋亡的作用特点，并进一步探讨死亡受体信号通路在复方君子汤诱发肿瘤细胞凋亡中的作用，更深入的了解复方君子汤抑制肿瘤的机理，从而为复方君子汤的临床应用提供更多的实验和理论依据。本实验研究结果表明，低剂量的复方君子汤（2.0mg/L）对K562的凋亡基本不起作用，而随着浓度的升高，6.0mg/L及10.0mg/L的复方君子汤对K562细胞的抑制率及凋亡比例与空白对照组比较均有统计学差异（P<0.01），且与药物浓度及使用时间呈正相关，其中6.0mg/L的复方君子汤组中I（562细胞早期凋亡比例明显增高，而10.0mg/L的复方君子汤组中则以晚期凋亡为主。白血病K562细胞经一定浓度的复方君子汤作用后caspase-8及Fas蛋白表达水平明显升高，与空白对照组比较有明显统计学差异（P<0.01），说明复方君子汤可能是通过上调Fas蛋白及caspase-8蛋白的表达进而诱导K562细胞的凋亡。

随着分子生物学的突飞猛进，在中医药理论指导下，从中医药宝藏中挖掘分子靶向白血病治疗药物具有广阔的前景。近几年来中药有效成分诱导白血病细胞凋亡分子机制的研究取得重大突破，特别是靶向凋亡通路相关蛋白或酶的表达或功能调控的研究成为其中的热点。如青蒿琥酯可诱导K562细胞凋亡，且具有时间一效应关系，同时上调K562细胞Fas蛋白的表达，下调FasL的表达，Fas/FasL表达的改变可能是青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡的机制之一。葛根总黄酮提取物及葛根素、大豆苷元单体均能诱导HL-60细胞凋亡，且可能是Fas死亡受体和/或线粒体途径所介导。姜黄素可诱导髓系白血病细胞凋亡，引起Fas水平增高，同时Caspase-8和Caspase-9都显著增高，故推断其可能通过死亡受体途径和线粒体途径来诱导细胞凋亡。这些报道表明Fas/FasL通路的激活可能是不同抗腫瘤中药活性成分诱导凋亡的共同分子途径。Fas的凋亡信号主要是通过与其胞浆区相关的死亡结构域蛋白FADD介导的，当Fas与FasL结合后，活化细胞死亡蛋白酶caspase-8，使其活化成具有酶活性的蛋白酶，随之活化连锁链，导致细胞凋亡。本实验表明复方君子汤对白血病K562细胞有明显的抑制生长增殖及诱导凋亡的作用，且与上调Fas蛋白及easpase-8蛋白表达有关，因此，我们推测复方君子汤对白血病K562细胞的凋亡机制可能与Fas-FADD-caspase-8轴有着密切关系，但仍需进一步实验研究探索。

综上，通过初步研究证实了一定浓度的复方君子汤在体外可抑制白血病K562细胞增殖并诱导其凋亡，其可能与上调Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表达有密切的关系。但复方君子汤诱导K562细胞凋亡的分子机制可能非常复杂，值得进一步深入研究。

（收稿日期：2016-11-28）