HPLC测定新疆紫草不同部位中8种羟基萘醌的含量

昝珂+郑凰雅+刘杰+过立农+郑健+马双成

[摘要] 建立同时测定新疆紫草Arnebia euchroma不同部位中左旋紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β， β′-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰紫草素等8种羟基萘醌含量的高效液相色谱法。采用Waters Xbridge C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈-0.05%甲酸水溶液（70∶30），检测波长275 nm，流速1 mL·min^-1，柱温30 ℃。定量结果显示，新疆紫草各部位中主要成分含量差异较大，根皮含量最高，其次是根，再次是茎残基，根木质部和地上部分含量较低。本研究为确定紫草药用部位提供科学依据。

[关键词] 新疆紫草；高效液相色谱；不同部位；含量测定；羟基萘醌；β-羟基异戊酰紫草素；β， β′-二甲基丙烯酰阿卡宁；异戊酰紫草素

[Abstract] This present study is to develop an HPLC method for simultaneous determination of eight hydroxyl naphthoquinones， shikonin， β-hydroxy-isovalerylshikonin， acetylshikonin， β-acetoxy-isovalerylshikonin， deoxyshikonin， isobutyrylshikonin， β，β′-dimethylacrylshikonin and isovalerylshikonin. The eight constituents were measured on a Waters Xbridge C18 column （4.6 mm×250 mm，5 μm） with isocratic elution of acetonitrile-0.05% formic acid solution （70∶30） at a flow rate of 1.0 mL·min^-1. The detection wavelength was 275 nm and the column temperature was 30 ℃. The results of content determination indicated that significant differences of the eight compounds exist in every part of Arnebia euchroma，in which the highest part was the root bark， followed with the root， then the stem residues. The content of the xylem of root and aerial part was lower than the above parts. The results provided scientific basis for the medicinal parts of A. euchroma.

[Key words] Arnebia euchroma；HPLC；different parts；content determination；hydroxyl naphthoquinones；β-hydroxy-isovalerylshikonin；β， β′-dimethylacrylshikonin；isovalerylshikonin

紫草为常用药材，最早见于《神农本草经》，历代本草均有收载。新疆紫草是1990年到2015年版《中国药典》[1-6]中收录的紫草药材之一，来源于软紫草属的新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst的干燥根，具有清热凉血，活血解毒，透疹消斑，用于血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤。

市场上销售的新疆紫草不同批次的药材性状差别较大，2015年版《中国药典》一部规定新疆紫草表面紫红色或紫褐色，皮部疏松，常10余层重叠，易剥落，顶端常有较大的茎残基，木部较小，黄白色或黄色。市售新疆紫草药材有的批次仅有根皮，有的批次带有较大茎残基部分，甚至带有绿色的茎叶等地上部分；根的木部大小不一，小的圆形直径1～3 mm，大的半月形或圆柱形，直径超过1 cm。

紫草中化学成分报道较多，主要活性成分为紫草素及其衍生物等羟基萘醌等紫色成分[7]。关于紫草药材的含量测定报道已有多篇[8-10]，主要集中在紫草根的含量测定，最多同时测定7种主要成分。周健等[11]采用HPLC测定了新疆紫草的根和茎残基中的β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁和紫草素的含量，根中含量高于茎残基2倍以上。但未见有采用高效液相色谱法同时测定地上部分以及根木质部中化学成分的文献报道。紫草各部位差别较大，根的木部以及地上非紫色部分中含羟基萘醌类成分较低。不同部位在药材中的比例将直接影响药材的质量，有必要对紫草各部位有效成分的含量进行系统研究。本实验选择左旋紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰紫草素等8种羟基萘醌类成分为指标，建立HPLC法对新疆紫草药材以及根皮、木部、茎残基以及地上部分（主要是茎叶等非紫色部分）进行了含量测定。本研究通过比较紫草不同部位8种活性成分含量，可进一步控制市售药材紫草的质量，并为确定紫草药用部位提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

安捷倫1260型高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器、四元泵、自动进样器），QUINTIX313-1CN型1/1万电子天平（Sartorius公司），MSE125S型1/10万电子天平（Sartorius公司），纯水仪（Millipore公司），超声波清洗器（KQ-300G型，昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

左旋紫草素（批号110769-200405），β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁（批号111689-201504）由中国食品药品检定研究院提供；β-羟基异戊酰紫草素（批号 PEL2204）由日本和光纯药工业株式会社提供；乙酰紫草素（批号 15062715）由上海士锋生物技术有限公司提供；去氧紫草素（批号 AB52-LSEG）由日本化成工业株式会社提供；β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁（批号 P20N6FC331），异丁酰紫草素（批号 02D6Z6828），异戊酰紫草素（批号 Z1357B20931）由上海源叶生物技术有限公司提供。甲酸、甲醇和乙腈为色谱纯，由Fisher公司提供，石油醚（60～90 ℃）由国药集团化学试剂公司提供，水为Milli-Q超纯水。

1.3 药材

样品采自新疆维吾尔族自治区博尔塔拉州、伊犁州和巴音郭楞州等地，经中检院民族药室郑健研究员鉴定为紫草科软紫草属新疆紫草A. euchroma的全株，60 ℃低温烘干后，每批样品经分离得到根、根皮、根木部、茎残基以及地上部分共5个部位。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Waters Xbridge C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.05%甲酸水溶液 （70∶30）；检测波长275 nm；流速1 mL·min^-1，柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备

取左旋紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素各约10 mg，精密称定，分別置10 mL量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，即得各对照品单标储备液。分别取各对照品储备液适量置同一个10 mL量瓶中，加乙腈配制成上述8种成分分别为51.55，20.12，98.10，50.25，19.88，49.90，100.3，50.35 mg·L^-1的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取样品粉末（过4号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚（60～90 ℃）25 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz） 30 min，放冷，再称定质量，用石油醚（60～90 ℃）补足失重，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，蒸干，残渣加乙腈溶解，转移至10 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照品溶液及供试品溶液的色谱图，见图1。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取各对照品储备液0.1，0.2，0.5，1.0 mL分别置于4个10 mL量瓶中，加乙腈定容至刻度，摇匀，即得2～5号混合对照品溶液。精密吸取2号混合对照品溶液1 mL置于10 mL量瓶中，加乙腈定容至刻度，摇匀，即得1号混合对照品溶液。分别精密吸取1～5号混合对照品溶液及各单个对照品溶液（因样品中成分含量差异较大，混合对照品溶液无法满足线性范围，最高浓度采用单标试验）各10 μL，注入液相色谱仪，测定，以各对照品质量浓度（mg·L^-1）为X轴，以峰面积为Y轴，进行线性回归，各对照品回归方程和线性范围见表1。

结果表明，各对照品线性关系良好。

2.4.2 检测限与定量限 将2.2项的混合对照品溶液用乙腈逐级稀释后，按信噪比（S/N）约为3的对照品溶液浓度为检测限（LOD），以信噪比（S/N）约为10的对照品溶液浓度为定量限（LOQ），结果见表1。

2.4.3 精密度试验 精密吸取2.2项对照品混合溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积。结果左旋紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰紫草素的峰面积的RSD分别为0.94%，0.64%，0.35%，0.34%，0.28%，0.45%，0.55%，0.65%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性考察 取样品粉末（样品4的根部）6份，分别按照2.3项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱方法测定，记录峰面积，计算含量。结果各份供试品溶液的左旋紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰紫草素的测定结果RSD （n=6）分别为2.2%，1.6%，2.0%，1.8%，1.3%，1.7%，1.9%，2.0%，结果表明重复性良好。

2.4.5 溶液稳定性试验 取同一份供试品溶液（样品4的根部），室温下分别放置0，2，4，8，12，24 h后进样测定。结果左旋紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰紫草素的峰面积的RSD （n=6）分别为1.9%，1.1%，0.63%，0.77%，0.88%，0.94%，0.51%，0.43%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.6 加样回收率试验 分别取左旋紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰紫草素适量，精密称定，置量瓶中，加乙腈溶解配制成质量浓度分别为0.142 5，0.055 2，2.512，1.212，0.030 5，0.402 5，1.518，3.506 g·L^-1的对照品溶液。取已知含量的供试品粉末（样品4的根部）6份，每份各约0.25 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入上述8种对照品溶液各1.0 mL，再精密加入石油醚（60～90 ℃）17 mL，之后操作参照2.3项方法平行制备供试品溶液，进样分析，计算回收率，结果见表2，表明该方法加样回收试验结果良好。

2.5 样品含量测定

精密称取紫草药材及其各部位药材粉末0.5 g，分别按2.3项方法制备供试品溶液。精密吸取各供试品溶液10 μL，按2.1项色谱条件进行测定，用外标法计算出左旋紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰紫草素的含量，结果见表3。

3 讨论

本文色谱条件和溶液制备方法参考2015年版《中国药典》一部含量测定项下优化而成。羟基萘醌类成分极性较小，由于乙腈-0.05%甲酸水溶液（70∶30）为流动相，样品采用石油醚（60～90 ℃）提取后，残渣用乙腈溶解制备供试品溶液；对照品溶液亦采用乙腈溶解制备。

4 结论

从各部位含量测定结果分析，所测8批药材中药典指标性成分β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁均符合《中国药典》2015年版一部规定。从所测8种羟基萘醌总量看，根皮中总含量最高，其次是根，再次是茎残基，根木部和地上部分中含量较低，见图2。由于新疆紫草各部位中有效成分含量差别较大，加工药材时应控制茎残基的比例，地上部分和根木部能否药用，尚需进一步研究。

本文首次建立新疆紫草中8种羟基萘醌的含量测定方法，其中β-羟基异戊酰紫草素的含量测定为首次报道，并对新疆紫草不同部位进行了含量测定研究，对全面控制紫草药材的质量具有较好的参考意义。

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[责任编辑 丁广治]