DNA条形码鉴定研究

刘 莉、张仕林、杨 飞*、沈开文、王 迅

（贵州汉方药业贵州省贵阳市，贵州 贵阳 550000）

DNA条形码鉴定研究

刘 莉、张仕林、杨 飞*、沈开文、王 迅

（贵州汉方药业贵州省贵阳市，贵州 贵阳 550000）

目的 探究应用DNA条形码对大黄类药物分类的效果。方法 提取四川、甘肃、青海、西藏、云南、宁夏6省份的40份样品叶绿体matK基因序列进行PCR扩增，将不同产地大黄的matK基因进行对比，以进行鉴定工作。结果 将提取的基因序列进过严格仔细的对比，能够发现40类样品中细微的差别。结论 通过DNA条形测序工作可以对大黄进行明确的品种分类。

大黄；matK基因

大黄有非常实用的临床药效，在中医临床中有广泛的应用，其主要的功效为泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄等。正品大黄为蓼科大黄属的唐古特大黄、掌叶大黄或者药用大黄的根茎。近年来随着需求量的增大，以及野生大黄数量的急剧下降，在药材市场流通有大量的假冒伪劣产品。中药材的鉴别一直是一个热门的话题，人们长期寻找一种准确的鉴别方法。以前大多数是经有经验的药师通过外观、气味等方面进行鉴别。这就有非常的主观性，准确率比较低。今年来随着基因学的发展，人们通过对大黄基因学的研究，发现可以通过DNA序列的对比，可以对大黄进行准确的鉴别和分类。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取产自四川、甘肃、青海、西藏、云南和宁夏6个省份的40份样品进行鉴定。这些样本经过专家鉴定为大黄，并保存相应的样本以备查验。

1.2 方法

从大黄药材根部中间部位选取20 mg，放入研磨器材中，加入液氮经过充分的研磨成粉状。然后用广谱植物基因提取试剂盒提取DNA，提取过程中进行充分的水浴，加入AP3缓冲液后高速离心1 min抽取上清液。将得到的DNA在-20℃的环境下保存待用。

用上海生工生物工程技术有限公司生产的由日本研发的3对引物，将目的基因进行PCR的扩增。引物信息以及退火温度详见表一。反应体系的构成：灭菌ddH2O 30 μL，10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L MgCl24 μL，dNTP4μL，引物各2 μL，DNA 模板2 μL，TaqDNA 聚合酶lμL。按照预先设计好的扩增程序进行PCR扩增。具体步骤为95℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火50 s，72℃延伸1 min，总共进行35个循环。将扩增的结果进行琼脂糖凝胶电泳检测后，送到上海生工生物工程技术有限公司进行测序[1]。

2 结 果

将所得的序列结果与文献中提供的序列进行分析对比，将序列100%相同的归为同一个基因组，有任何不同的视为不同基因型。某些样品经过PCR扩增后检测不到DNA，这可能是因为提取样品纯度不够，杂质过多影响了引物和相应基因的结合所导致。对于未检测到DNA的样品进行进一步的纯化后，再进过相同的流程得出了满意的结果。经过基因学分析大黄的matK基因序列全长在1518 bp～1524 bp之间，总共发现57个变异点，各个品种间有显著差异的特异位点区分。所有大黄的平均遗传距离为0.0421，最大遗传距离为0.4521，最小遗传距离为0.0036[2]。

表1 本研究中所用PCR引物的基本资料

3 讨 论

中药材由于炮制过程以及纯度的问题使得DNA的提取难度增大，有些研究中采用对ITS基因的扩增进行基因序列的研究，但是ITS除了大黄外，在一些真菌中的含量也十分的丰富。中药材中常含有不同程度的真菌，因此该基因序列检测的准确度大大降低。而本文中所采用的matK基因就很好的避免了这个问题，使检测的准确性以及可靠性大幅度的增加。本文中的检测样品量还不是十分充足，因此应进一步的研究，以便达到更好的鉴定效果。

[1] 李美妮,韩蕊莲,等.大黄与易混伪品土大黄、虎杖原植物的ITS2序列鉴定[J].环球中医药,2012,5(3):185-189.

[2] 张晓芹,刘春生,等.多基原药材大黄叶绿体matK基因序列分析及鉴定研究[J].药学学报,2013,48(11):1722-1728.

本文编辑：李 豆

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B

ISSN.2095-6681.2017.08.72.01

科学技术部重大新药创制专项子课题（2014ZX09301308-007）：苗药芪胶升白胶囊技术改造及再评价研究，负责人：刘 莉。贵阳国家高新区科技计划项目（合同编号：GXKH2015-20）：芪胶升白胶囊处方药材DNA条码的建立项目

杨 飞，执业药师，主要研究方向：中药学。