棉铃虫甾醇载体蛋白2原核表达及纯化

杜新凯，任 娟，胡 珺，王常高，林建国，蔡 俊，杜 馨

(湖北工业大学 发酵工程教育部重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，工业微生物湖北省重点实验室，湖北 武汉 430068)

棉铃虫甾醇载体蛋白2原核表达及纯化

杜新凯，任 娟，胡 珺，王常高，林建国，蔡 俊，杜 馨*

(湖北工业大学 发酵工程教育部重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，工业微生物湖北省重点实验室，湖北 武汉 430068)

甾醇载体蛋白2(SCP-2)在昆虫体内甾醇吸收及运输过程中有着重要的生理功能。试验构建重组表达质粒pET-22b/HaSCP2，转化至E.coliBL21 (DE3)进行诱导表达，并对IPTG浓度、诱导时间及温度进行优化，经Ni柱分离纯化后分析其与胆固醇结合活性。SDS-PAGE分析表明，重组蛋白相对分子质量约为16 ku，且在25 ℃，IPTG终浓度0.2 mmol·L-1下诱导10 h为最佳诱导表达条件。经荧光探针8-苯胺-1-萘磺酸(1，8-ANS)竞争分析，胆固醇与HaSCP-2结合半数有效浓度(EC50)为29.03 μmol·L-1。该研究为深入研究棉铃虫SCP-2的功能以及后续HaSCP-2抑制剂的筛选研究奠定了基础。

棉铃虫；甾醇载体蛋白2；原核表达；原核纯化；原核优化

甾醇载体蛋白(sterol carrier protein-2，SCP-2)又称非特异性脂转运蛋白(non-specific lipidtransfer proteins，nsLTPs)，是一类碱性可溶的低分子量蛋白质，广泛存在于动物、植物、细菌、真菌中[1]。已知的含SCP-2结构域家族包括：SCP-2、SCP-x、类SCP-2(SCP-2-like)、17-β-羟基固醇脱氢酶Ⅳ (17-β-hydroxysteroid dehydrogenase-4)、短链脱氢酶(short-chain dehydrogenase) 和血红细胞膜整合蛋白(stomatin)。SCP-2主要参与胞内胆固醇、脂肪酸和脂肪酸辅酶A的吸收、转运、氧化、酯化，以及磷脂代谢和信号传递等[2-3]。与哺乳动物不同，昆虫自身不能合成类固醇，必须从食物中获取谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和麦角甾醇等植物甾醇，再转化为自身必须的胆固醇[4-5]。因此，昆虫SCP-2在甾醇代谢过程中扮演重要的角色。

目前，已在果蝇(Drosophilamelanogaster)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)、棉贪夜蛾(Spodopteralittoralis)、家蚕(Bombyxmori)、斜纹夜蛾(Spodopteralitura)、烟草天蛾(Manducasexta)和棉铃虫(Helicoverpaarmigera)[6-12]等多种昆虫中发现了SCP-x/2基因。SCP-2蛋白在体内独立表达，其大小约13～16 ku。SCP-2功能研究发现，在培养的埃及伊蚊、斜纹夜蛾细胞中超表达SCP-2，促进了胆固醇的吸收和积累。此外，埃及伊蚊、斜纹夜蛾、棉铃虫幼虫RNA干扰与定点突变明显降低胆固醇的水平[13-16]。目前，关于SCP-2在体内胆固醇详细的转运机制仍不清楚。

棉铃虫是一类极具破坏性的世界农业害虫，对棉花，玉米，番茄和小麦等至少60种宿主植物造成危害[17]。据统计，棉铃虫已对多种杀虫剂如拟除虫菊酯类、烟碱类、阿维菌素、多杀菌素、有机磷、氨基甲酸酯以及Bt毒素等产生抗性[18]。近年来关于昆虫SCP-2抑制剂研究发现，埃及伊蚊SCP-2抑制剂(AeSCPIs)抑制蚊子和烟草天蛾幼虫对胆固醇的吸收，同时具有明显的致死效果[11，19-20]。此外，对棉铃虫的研究发现，AeSCPIs影响幼虫发育，对低龄幼虫具有致命性，同时推迟幼虫化蛹和化蛾时间，降低卵孵化率[12]。昆虫SCP-2作为新的害虫防治的靶点，对新型杀虫剂的开发具有重要意义。本文通过克隆棉铃虫SCP-2基因，进行构建表达载体，原核表达及其蛋白活性分析为进一步HaSCP-2的生物学功能和后续HaSCP-2抑制剂的筛选研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验用昆虫、菌株及质粒

试验用棉铃虫购自湖北生物农药工程研究中心，实验室培养。大肠埃希菌E.coliBL21(DE3) 及质粒载体pET-22b由本实验室保存。

1.2 主要试剂及仪器

质粒DNA提取试剂盒，第一链cDNA合成试剂盒购自天根生化科技有限公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶(NdeⅠ和XhoⅠ)、DNA Marker及PCR试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；Taq聚合酶、蛋白Marker购自Thermo scientific公司；氨苄青霉素(Amp)、IPTG购自Amresco公司；8-苯胺-1-萘磺酸(1， 8-ANS)购自阿拉丁生化科技有限公司；胆固醇购自国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。引物合成、测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

VeritiTMPCR仪购自美国ABI公司；ZHWY恒温摇床购自上海智诚分析仪器制造有限公司；JY92-11超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司；DYCZ-24DN蛋白质电泳仪购自北京六一仪器厂；NGC蛋白层析仪购自美国BIO-RAD公司；Synergy2酶标仪购自美国BioTek公司；GBOX凝胶成像仪购自英国Syngene公司。

1.3HaSCP-2基因原核表达载体的构建及鉴定

棉铃虫中肠总RNA提取及第一链cDNA合成参照文献[12]。根据HaSCP-x基因序列(GenBank JN582013)设计HaSCP-2扩增引物HaSCP-2F：ATCATATGATGTACCGCAAAGGATTC和HaSCP-2R：GTCTCGAGCCTATTTACAGTTTGGAACGA，添加NdeI和XhoI酶切位点。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系：cDNA 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，HaSCP-2F 0.5 μL，HaSCP-2R 0.5 μL，Taq连接酶 0.5 μL，加无菌水至25 μL。反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72℃延伸2 min。通过PCR扩增得到HaSCP-2基因序列，经酶切后插入同样酶切的pET-22b载体上。转化至大肠埃希菌E.coliBL21(DE3)中，在含氨苄青霉素(100 μg·mL-1)的LB平板上37 ℃过夜培养12 h。筛选阳性克隆单菌株，根据质粒DNA提取试剂盒说明书提取重组质粒并进行PCR扩增鉴定及测序鉴定。

1.4 HaSCP-2蛋白的诱导表达及条件优化

取阳性单克隆菌株接种于含终浓度100 μg·mL-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃、180 r·min-1过夜培养10 h。再以1%接种量接种到含新鲜氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，至D600值为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度0.3 mmol·L-1于30 ℃、220 r·min-1诱导表达10 h。培养菌液经5 000 r·min-1离心5 min，PBS(pH 7.3)重悬后，加入Loading buffer，加热煮沸5 min，通过15% SDS-PAGE电泳分析菌体重组蛋白表达情况。

1.4.1 诱导剂IPTG浓度的优化

按上述方法活化含重组质粒菌株，以1∶50比例接种到新鲜培养基中，至D600值为0.6～0.8时分别加入终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol·L-1的IPTG，30 ℃、220 r·min-1诱导表达10 h。收集菌液，经离心、PBS(pH 7.3)重悬后，通过12% SDS-PAGE电泳分析菌体重组蛋白表达情况。

1.4.2 诱导温度的优化

重组质粒菌株培养同上，在最适IPTG浓度条件下，分别在20、25、30和37 ℃条件下220 r·min-1诱导10 h。收集菌液，经离心、PBS(pH 7.3)重悬后，通过12% SDS-PAGE电泳分析菌体重组蛋白表达情况。

1.4.3 诱导时间的优化

重组质粒菌株培养同上，在最适IPTG浓度和最适温度情况下，220 r·min-1分别诱导2、4、6、8、10和12 h。收集菌液，经离心、PBS(pH 7.3)重悬后，通过15% SDS-PAGE电泳分析菌体重组蛋白表达情况。

1.5 HaSCP-2蛋白的纯化

取阳性重组菌活化后，以1∶100比例扩大培养，按诱导表达优化后条件进行诱导表达。收集菌液，5 000 r·min-1离心5 min，PBS(pH 7.3)重悬后，再离心并用平衡缓冲液(25 mmol·L-1咪唑，20 mmol·L-1Tris-HCl，150 mmol·L-1NaCl，pH 8.0)重悬，于冰浴中超声破碎裂解，功率180 W，超声6 s，间隔4 s。10 000 r·min-1，4 ℃，离心15 min，取上清液。将上清液经0.45 μm滤膜过滤后于镍离子层析柱进行亲和纯化，用洗脱缓冲液(300 mmol·L-1咪唑，20 mmol·L-1Tris-HCl，150 mmol·L-1NaCl，pH 8.0)梯度洗脱目的蛋白。纯化后的蛋白在冰水浴下透析约10 h，再经超滤管浓缩。通过15%的SDS-PAGE电泳分析HaSCP-2重组蛋白的纯度，采用Bradford法[21]测定纯化的蛋白浓度。

1.6 HaSCP-2蛋白与胆固醇结合活性

使用8-苯胺-1-萘磺酸(1，8-ANS)荧光探针检测其与HaSCP-2蛋白结合能力。在200 μL反应体系中，加入纯化后的重组HaSCP-2蛋白终浓度为30 mmol· L-1，不同终浓度的1，8-ANS分别为0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50和55 μmol·L-1。孵育3 min后，酶标仪检测，激发光360 nm，发射光460 nm，狭缝均为20 nm。记录HaSCP-2蛋白和不同浓度1，8-ANS反应后的荧光值，分析结合能力，计算公式：Y=Bmax×X/(Kd+X)。

胆固醇与HaSCP-2蛋白结合亲和力通过竞争取代分析测定。在96孔荧光酶标板中，10 μmol·L-1重组HaSCP-2蛋白与20 μmol·L-11，8-ANS混合反应2 min，在加入不同浓度胆固醇溶液(终浓度5、10、20、50和100 μmol·L-1)，反应3 min后记录荧光值。通过单位点竞争结合，非线性回归分析计算半数效应浓度(EC50)，计算公式为：Y=Best fit value MIN + (Best fit value MAX-Best fit value MIN)/(1+10(X-lgEC50)) 。

2 结果与分析

2.1HaSCP-2基因原核表达载体的构建及鉴定

从棉铃虫中肠总RNA反转录得到cDNA序列，以HaSCP-2F和HaSCP-2R为引物扩增得到HaSCP-2基因序列，经NdeI和XhoI酶切插入同样酶切的pET-22b载体上，转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，挑选阳性克隆菌提取重组质粒，PCR鉴定(图1)和基因测序验证，测序结果与NCBI上HaSCP-2序列一致，表明成功构建重组质粒。

M， DL2000 DNA Marker；1， pET-22b/HaSCP2重组质粒PCR产物M，DL2000 DNA Marker；1，pET-22b/HaSCP2 plasmids PCR product图1 重组pET-22b/HaSCP2质粒PCR鉴定Fig.1 Identification of pET-22b/HaSCP-2 plasmids PCR amplification

2.2 HaSCP-2蛋白的诱导表达及条件优化

取含重组质粒pET-22b/HaSCP-2的BL21(DE3)菌株进行培养，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳分析结果表明，在16 ku左右出现一条蛋白带，与目标蛋白分子量相符；未诱导重组菌则无该蛋白表达。由此可见，该蛋白条带为重组HaSCP-2蛋白。

通过对诱导剂IPTG浓度，诱导温度和诱导时间进行优化，SDS-PAGE电泳结果显示在30 ℃、不同IPTG浓度下诱导10 h，目标蛋白的表达量并没有太大变化(图2)。高浓度的IPTG没有明显增加蛋白含量，考虑到高浓度IPTG对细胞的抑制影响，选择最佳IPTG浓度为0.2 mmol·L-1；分别在20、25、30和37 ℃，终浓度0.2 mmol·L-1IPTG下诱导10 h(图3)，蛋白表达量在25 ℃时最大，随着温度的升高，蛋白表达量明显下降，因此选择最佳诱导温度25 ℃；在25 ℃，终浓度0.2 mmol·L-1IPTG下分别诱导2、4、6、8、10和12 h(图4)，在0～10 h蛋白表达量随着时间的增加而增加，10 h后表达量稳定，因此选择最佳诱导时间为10 h。

M， 蛋白质分子量标准；1～2， 未诱导组；3～8， 不同浓度IPTG浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol·L-1)处理组M， Marker; 1-2， Non-induced group; 3-8， Treatments of different concentrations of IPTG (0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0， 1.2 mmol·L-1)图2 诱导剂IPTG对重组HaSCP-2蛋白表达的影响Fig.2 Effects of IPTG concentrations on the expression of recombinant HaSCP-2 protein

2.3 HaSCP-2蛋白的纯化

在最佳诱导条件下对重组菌大量诱导表达，经亲和镍柱结合后，在150 mmol·L-1咪唑浓度下开始洗脱蛋白，再透析脱盐。纯化产物经SDS-PAGE分析，在16 ku处得到较纯的重组HaSCP-2蛋白，含量在90%以上。纯化的蛋白经Bradford法测得的浓度为1.003 mg·mL-1(图5)。

M， 蛋白质分子量标准；1～4， 不同诱导温度(20、25、30和37 ℃)实验组；5， 未诱导组M， Marker; 1-4， Treatments of different temperature (20， 25， 30， 37 ℃); 5， Non-induced group图3 诱导温度对重组HaSCP-2蛋白表达的影响Fig.3 Effects of induced temperature on the expression of recombinant HaSCP-2 protein

M， 蛋白质分子量标准；1， 未诱导组；2～6， 实验组不同诱导时间依次为2、4、6、8、10和12 hM， Marker; 1， Non-induced group; 2-6， Treatments of different induced time (2， 4， 6， 8， 10， 12 h)图4 诱导时间对重组HaSCP-2蛋白表达的影响Fig.4 Effects of induced time on the expression of recombinant HaSCP-2 protein

2.4 HaSCP-2蛋白与胆固醇结合活性

荧光探针1，8-ANS与HaSCP-2蛋白结合曲线如图6所示，随着1，8-ANS浓度的升高，荧光强度逐渐升高，在50 μmol·L-1浓度后荧光值趋于饱和，表明蛋白和1，8-ANS有效结合。通过单位点结合、非线性回归分析得到HaSCP-2蛋白与1，8-ANS的结合常数为1.973 μmol·L-1(R2= 0.98)。

HaSCP-2蛋白与1，8-ANS结合后，通过不同浓度胆固醇竞争取代1，8-ANS。如图7，随着胆固醇浓度的升高，体系相对荧光强度(relative fluorescence units，RFU)降低，表明荧光探针1，8-ANS被胆固醇从蛋白结合位点竞争取代，通过计算得到胆固醇结合半数有效剂量EC50值为29.03 μmol·L-1。

M， 蛋白质分子量标准；1， 未诱导菌液；2， 诱导后菌液；3， 经镍柱纯化重组HaSCP-2蛋白；4， 透析后重组HaSCP-2蛋白M， Marker; 1， Non-induced bacteria liquid; 2， Induced bacteria liquid; 3， Recombinant HaSCP-2 protein purified through Ni2+-affinity column; 4， Recombinant HaSCP-2 protein after dialysis图5 重组HaSCP-2蛋白的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant HaSCP-2 protein

图6 HaSCP-2蛋白与1，8-ANS结合曲线Fig.6 Binding curve of HaSCP-2 protein and 1，8-ANS

图7 1，8-ANS与胆固醇竞争结合HaSCP-2分析Fig.7 Competitive binding assay of 1，8-ANS in HaSCP-2 with cholesterol

3 讨论

昆虫SCP-2蛋白在中肠细胞中表达量最高，能更好的吸收胆固醇，对昆虫正常生长、发育和繁殖起着重要的作用[11-12，22]。本研究从棉铃虫中肠提取RNA，克隆HaSCP-2基因，选用大肠埃希菌做为克隆和表达。大肠埃希菌易繁殖培养，已被广泛应用于表达宿主菌。pET-22b系统所带His标签小，不影响目的蛋白结构和功能，且蛋白表达量大，易纯化，故以此进行克隆表达。PCR条带单一，且序列一致，说明该载体可用于重组HaSCP-2表达。重组蛋白原核表达受诱导剂、诱导温度和时间的影响，对诱导条件优化可提高重组蛋白的产量。在不同IPTG浓度下，重组蛋白产量并没有显著变化，高浓度的IPTG可能抑制重组蛋白的表达，因此低浓度的IPTG浓度更适合用于诱导表达。随着温度的升高，蛋白产量反而下降，这表明30～37 ℃下菌体更容易生长。在最适IPTG浓度和诱导温度下，蛋白量不断积累，10 h后蛋白量变化不大。因此，重组蛋白最佳诱导表达条件为25 ℃，IPTG终浓度0.2 mmol·L-1下诱导10 h。

SCP-2与配体结合亲和力通过竞争取代分析，常用的荧光探针有NBD放射标记胆固醇(NBD-cholesterol)[14]和8-苯胺-1-萘磺酸(1，8-ANS)[15]。1，8-ANS相比NBD胆固醇更加廉价，且适合大规模药物筛选。1，8-ANS在水溶液中几乎无荧光，但是与蛋白疏水性表面结合后发出荧光，因此可用来作为探针用于竞争取代分析。重组HaSCP-2与1，8-ANS结合后发出荧光，可判断1，8-ANS结合到蛋白疏水腔中，天然底物胆固醇竞争取代1，8-ANS后荧光强度下降，表明蛋白具有生物学活性，且半数有效剂量EC50值为29.03 μmol·L-1。综上所述，本试验可为后续HaSCP-2抑制剂的研发及SCP-2特异性新型农药的研发奠定基础。

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(责任编辑 张 韵)

Prokaryotic expression and purification of sterol carrier protein-2 fromHelicoverpaarmigera

DU Xinkai， REN Juan， HU Jun， WANG Changgao， LIN Jianguo， CAI Jun， DU Xin*

(KeyLaboratoryofFermentationEngineering(MinistryofEducation)，HubeiProvincialCooperativeInnovationCenterofIndustrialFermentation，HubeiKeyLaboratoryofIndustrialMicrobiology，HubeiUniversityofTechnology，Wuhan430068，China)

Sterol carrier protein 2 (SCP-2) plays important physiological roles in sterols absorption and transport in insects. In this study， the recombinant expression plasmid pET-22b/HaSCP2 was constructed and transformed intoE.coliBL21 (DE3) for inducible expression. Induction conditions of the IPTG concentrations， the induction time and temperature were optimized. The recombinant HaSCP-2 was purified using Ni2+-affinity column， and the protein functions of HaSCP-2 was tested by competitive displacement assay. SDS-PAGE analysis suggested that the molecular weight of the recombinant protein was about 16 ku， and the optimal expression conditions were at the temperature of 25 ℃ and at the final concentration of 0.2 mmol·L-1IPTG for 10 h. Fluorescent probe 8-aniline-1-naphthalenesulfonic acid (1，8-ANS) was used for competitive analysis， and 1，8-ANS was replaced by cholesterol bound to HaSCP-2 with a half effective concentration (EC50) of 29.03 μmol·L-1. This study provides good opportunity for further study on the function of HaSCP-2 and the screening of HaSCP-2 specific inhibitors.

Helicoverpaarmigera; sterol carrier protein-2; prokaryotic expression; prokaryotic purification; prokaryotic optimization

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.15

2017-02-22

国家自然科学基金项目(31401807)；湖北工业大学高层次人才科研启动项目(BSQD13002)；湖北工业大学大学生创新创业项目(201510500064)

杜新凯(1991—)，男，河南灵宝人，硕士研究生，研究方向为发酵过程优化。E-mail: duxinkai78@163.com

*通信作者，杜馨，E-mail: 99023801@qq.com

S435

A

1004-1524(2017)07-1166-06

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(7): 1166-1171

杜新凯，任娟，胡珺，等. 棉铃虫甾醇载体蛋白2原核表达及纯化[J].浙江农业学报，2017，29(7)： 1166-1171.