滇龙胆香叶醇10-羟化酶基因的克隆与表达分析

张晓东，李彩霞，李 爽，刘倩倩，王元忠，王家金*

(1.玉溪师范学院资源环境学院，云南 玉溪 653100；2.云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650223)



滇龙胆香叶醇10-羟化酶基因的克隆与表达分析

张晓东1，李彩霞1，李 爽1，刘倩倩1，王元忠2，王家金2*

(1.玉溪师范学院资源环境学院，云南 玉溪 653100；2.云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650223)

【目的】克隆滇龙胆香叶醇10-羟化酶基因GrG10H(geraniol 10-hydroxylase)，分析其生物信息学特征、基因结构、蛋白表达和组织表达情况，为龙胆苦苷生物合成途径解析提供理论依据。【方法】通过RT-PCR及基因克隆方法，从滇龙胆总RNA中克隆得到基因GrG10H及其基因组序列；使用生物信息学方法分析其DNA序列及其编码蛋白特性，使用Clustal X2.1软件对GrG10H蛋白质及其同源序列做序列比对，使用MEGA7.0软件进行系统发育树构建；利用定量PCR技术分析GrG10H基因在滇龙胆根茎叶中的表达水平。【结果】使用RT-PCR方法从滇龙胆叶片中克隆得GrG10H基因全长为1834 bp，包含2外显子和1内含子，ORF 1548 bp，将序列提交至GenBank，得到序列号KJ418410。生物信息学分析表明，该基因编码515个氨基酸，分子量为57.74 kD，理论等电点为9.02；该蛋白属于细胞色素P450超家族成员，定位于内质网，其N端含一跨膜螺旋(21～43)，其中1～20氨基酸残基位于膜内，44～515位于膜外。该蛋白无信号肽，为亲水稳定蛋白，主要由无规则卷曲(44.85%)和α-螺旋(40.58%)构成。GrG10H蛋白与川西獐牙菜SmG10H蛋白具有较高的相似性(87%)，且亲缘关系最近。原核表达结果表明，GrG10H基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为83.74 kD (含GST标签26.00 kD)，与预期蛋白大小一致。组织特异性表达分析结果表明GrG10H基因主要在叶中表达。……