水稻根系耐镉促生菌的筛选

陆仲烟+杜国冬+时鹏涛+秦玉燕+王运儒

摘 要：根际促生菌（PGPR）是指生活于植物根际环境，并能直接或间接促进植物生长的微生物。PGPR能通过产生生长激素，铁载体、ACC脱氨酶和增加根系溶磷量等来促进植物生长，提高植物抗病性和抗逆性。本研究采用培养基加镉平板法分离出两株耐镉细菌，并对两株细菌对水稻的促生效应进行了验证。

关键词：水稻根；生菌

一、材料与方法

1.试验材料。水稻根际土壤（取于广西环江县Cd污染稻田），牛肉膏蛋白胨培养基。

2.耐镉细菌的分离。采用培养基加Cd平板法分离耐镉细菌 （陈金生等，2005）。取10 g水稻根际土放入装有90 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基和适量玻璃珠的三角瓶中，以150 rpm，37 ℃在摇床上振荡12 h。吸取0.1 mL，分别涂布在含Cd为0 mg/L，100 mg/L，300 mg/L，500 mg/L和1000 mg/L的培养基平板上，每个处理重复3次。将平板倒置至恒温箱中37 ℃培养24 h。再将以上平板上的菌株用平板划线法接种于Cd浓度为500 mg/L的培养基上，37 ℃培养24 h。将所得菌株在500 mg/L的培养基上重复接菌培养3次。最后将分离复筛所得的菌株在4 ℃下斜面保存于冰箱中。

3.耐镉细菌生长曲线的测定。在斜面保存的菌种中挑取1环菌落接入100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在摇床上以150 rpm，37 ℃培养12 h，得到种子培养液。吸取4 mL种子液加入含100 mL 液体培养基的三角瓶中，37 ℃，150 rpm 培养56 h，每4小时在分光光度计上测定在波长660 nm下的OD值，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制耐镉细菌的生长曲线。

4.耐镉细菌对水稻促生效应。用牛肉膏蛋白胨液体培养基在37 ℃，150 rpm，pH为5.5的条件下培养菌株。将培养24 h的菌种，在10000 rpm，25℃条件下离心10 min。去掉上清液，再用灭菌去离子水水重新悬浮菌体，重复3次，调节OD值，使有效活菌数为1×108 cfu/mL。将石英砂洗净后晒干，每盘1kg装于直径10 cm，高15 cm塑料盆中，备用。选取饱满均一的水稻种子在5% NaClO溶液中浸泡15分钟后，用蒸馏水洗净。播种于育苗盘中，待水稻苗子长到四叶一心后开始移苗。选长势大小均一的苗子移栽到装有石英砂的小塑料盆中，每盘6株，移完后浇灌500 mL的霍格兰营养液。加菌处理的部分水稻苗移栽前用有效活菌数为1×108 cfu/mL菌液液浸泡两个小时。在Cd处理的盆中，营养液浇灌前先添加CdCl2，使Cd浓度为5 mg/L。营养液用0.1 M HCl和0.1 M NaOH调节pH至5.5。每天浇灌营养液使液面保持在一定高度。移栽两周后往加菌处理里每盆注射10 mL的菌液于根系附近。培养30 d，每天观察记录水稻的生长情况。

二、结果与分析

1.耐镉菌株的获得。经分离复筛后，从水稻根际土壤中获得2株耐Cd细菌。菌株能在含500 mg/L Cd的牛肉膏蛋白胨培养基中正常生长。将菌株分别命名为菌株A和菌株B。菌株A为淡绿色，菌株B为浅红色。两菌株菌落均较小，呈圆形，表面光滑，菌落黏稠，容易挑取。

2.耐镉菌株的生长曲线。如图2.1所示，两菌株均在经历了4 h的延缓期后开始进入对数生长期，菌株A在24小时后进入进入稳定期，48 h后进入衰亡期，而菌株B约在28小时才后进入稳定期，44小时就进入衰亡期。在相同条件下，菌株B的细胞浓度较大，繁殖能力较强。

3.耐镉菌株对水稻生长的影响。Cd胁迫下，水稻生长受阻，植株生长矮小，叶片从老叶开始干枯，新叶黄化。两个菌株都未能缓解水稻受害症状。在无Cd条件下，接种处理也未能促进水稻生长。接菌处理与不接菌处理的水稻形态特征无差异。表明，两个菌株对水稻都没有促生效应。

三、结论

从南方Cd污染水稻田的水稻根际土中能分离筛选出耐镉细菌。所分离的两个菌株和伯克氏菌均能在500 mg/L的Cd胁迫下正常生长，有极强的耐镉能力。两个菌株对水稻没有促生效应。

四、讨论

PGPR能产生生长素并具有溶磷能力，生长素能促进根系伸长和不定根的发育，可提高植物对N、P等营养元素的吸收，促进作物生长 （Spaepen et al.， 2007； Mantelin et al.， 2004； Adesem et al.， 2008）。Vivas 等将从锌污染土壤中分离出来的Brevibacillus 属的PGPR应用到锌污染的土壤中，结果发现分离出来的PGPR能显著提高植物生物量，提高氮、磷的积累（Vivas et al.， 2006）。PGPR能增加紫花苜蓿的出苗率，增加根长、株高和生物量以及叶绿素含量 （安永辉等，2009）。接种芽孢杆菌DBM能有效缓解锌毒害，显著促进水稻生长，加菌处理比不加菌对照的地上部和根部干重分别高出97.8%和77.2%（陈佛保等，2012）。

将PGPR作为生防菌的研究报道较多，国内外现已发现包括根瘤菌、芽孢杆菌、荧光假单胞菌、沙雷氏属等20多个种属的根系微生物有作为生防菌的潜力。目前这一领域的研究已经深入到基因组学和蛋白质组学层面。PGPR生防菌可提高黄瓜对甲虫和马赛克病毒的抗性 （Ramamoorthy et al.， 2001），能有效防治水稻白叶病，降低病叶率 （王金生等，2001）。一般认为，PGPR提高植物抗病性的机理主要是PGPR抢先占据了植物根围和叶围中的竞争位点，并能产生水杨酸、嗜铁素等物质来诱导寄主植物对病原菌的抗性（康贻均，程洁，2010）。

PGPR能提高植物对干旱、盐分、重金属等非生物胁迫的忍耐力（康贻均，程洁，2010）。由于人地矛盾的突出和重金属污染土壤的加剧，PGPR在非生物胁迫领域特别是重金属胁迫逐渐成为研究的热点。在逆境胁迫下，植物会产生大量的乙烯，抑制植物生长，加速器官衰老。而PGPR产生的ACC脱氨酶能够降解乙烯合成的前体物质ACC，减少乙烯含量，从而缓解了逆境胁迫，提高植物抗逆能力（Penrose et al.， 2001； Glick et al.， 2007）。Zhang 研究发现，在重金属胁迫下，PGPR能提高植株体内POD、SOD、CAT的活性，抵御重金属产生的氧化胁迫，促进植物生长 （Zhang et al.， 2010）。一些耐重金属的PGPR可通过释放金属螯合剂，和改变氧化还原电位等来降低重金属的有效性，或降低其毒性，而使植物免受重金属的毒害。

参考文献：

[1]安永辉.植物促生菌对紫花苜蓿幼苗生长及生理的影响 [硕士学位论文].长春：东北师范大学，2009.

[2] 陈佛保，柏 珺，林慶祺，等. 植物根际促生菌（PGPR）对缓解水稻受土壤锌胁迫的作用.农业环境科学学报，2012，31 （1）：67-74.

[3]康贻均，程洁. 植物根系促生菌作用机制研究进展.应用生态学报，2010，21（1）：232-238.

[4] Abou-Shanab R.A.， Angle J.S.， Van Berkum P.. Chromate-tolerant bacteria for enhanced metal uptake by Eichhornia crassipes （Mart.）. Int J. Phytoremediation， 2007， 9 （2）： 91-105.

[5] Adesem A.O.， Torbert H.A.， Kloepper J.W.. Enhanced plant nutrient use efficiency with PGPR and AMF in an integrated nutrient management system. Canadian Journal of Microbiology， 2008， 54 （1）： 876- 886.

[6]Chen Zhaojin， Sheng Xiafang， He Linyan， et al.. Effects of root inoculation with bacteria on the growth， Cd uptake and bacterial communities associated with rape grown in Cd-contaminated soil. Journal of Hazardous Materials， 2013， 244 （1）： 709-717.