杜马斯燃烧法测定饲料粗蛋白的实验教学改革初探

朱国霞+哈玲津+王金娥+刘海学+白东清

摘 要：本项目组成员在科研中测定饲料粗蛋白时，分别利用杜马斯燃烧法和凯氏定氮法进行比较，得到可以用杜马斯燃烧法替代以凯氏定氮法的结论，并尝试将其引入饲料分析实验课中，避免凯氏定氮法的安全隐患及废液污染等问题，使学生既具备扎实的实验基础，又能应用到现代仪器，提高就业竞争力。

关键词：饲料；粗蛋白；杜马斯燃烧法；凯氏定氮法；实验教学改革

粗蛋白含量是衡量飼料原料和动物产品营养价值的一个重要指标，因此，准确测定动物饲料及其产品中的粗蛋白是动物饲养和营养的核心内容之一。本项目组成员除了实验课上指导学生做利用凯氏定氮法测定大量的饲料粗蛋白的实验外，还承担部分科研及对外检测的测定饲料粗蛋白的任务。凯氏定氮法是经典的测定饲料粗蛋白的方法，但由于其测定时间长，需要使用危险化学试剂，容易造成环境污染，因而随着人们对安全和环境问题的日益关注，分析设备的不断改进，本项目组尝试采用杜马斯燃烧法逐渐替代传统凯氏定氮法的可行性。我们经过在科研生产中大量的实验摸索，比较两种方法对实验结果及对操作人员和环境的影响，得出结论，杜马斯法可以作为饲料粗蛋白测定的优选方法替代凯氏定氮法。本文从饲料分析实验课教学改革角度分析杜马斯燃烧法替代凯氏定氮法测定饲料粗蛋白的必要性与可行性。

一、粗蛋白测定方法的发展趋势

饲料分析实验课是畜牧专业和水产养殖专业的一门重要的专业基础实验课，具有很强的实践性和操作性，内容广，实应性强。饲料企业和畜牧养殖业用人单位对毕业生的需求量逐年增加，为了适应人才市场对高级专门人才的需求，本项目尝试对饲料分析实验课的实验项目进行开发与调整，在保留经典实验项目的基础上，将仪器引入到课程里，让学生既能掌握基础的实验方法，又能接触到最新的实验技术。随着饲料行业的迅速发展，饲料的品质控制和安全已成为饲料生产厂家必不可少的关键环节，饲料粗蛋白的测定是饲料分析实验课的一个重要的实验项目，也是饲料生产与科研中必不可少的检测项目，本项目将原有的凯氏定氮法转变为杜马斯燃烧法，旨在减少环境污染及安全隐患，顺应科技发展，培养具备就业竞争力的农业院校毕业生。这仅是饲料分析实验课的一个尝试，今后还将继续摸索实验教学改革，力争将传统的饲料分析实验课程转变成适应行业发展需求的综合创新型实验课。

粗蛋白的测定方法主要有凯氏定氮法、杜马斯燃烧法、分光光度法和滴定法等。分光光度法简单迅速，灵敏度低。滴定法在操作过程中主要是靠实验者肉眼进行判断，所以容易产生误差。目前，国内高校粗蛋白的检测方法主要是经典的凯氏定氮法（GB/T 6432—1994），也是国家标准规定的方法，通过测定总氮量来计算蛋白质含量。传统的凯氏定氮装置需要人工进行仪器洗涤、安装、试剂添加、滴定等步骤，过程复杂，操作繁琐，耗时耗力且误差来源较多，尤其不利于大批量样品的检测。与传统装置相比，近代的凯氏定氮仪实现了部分测定的自动化，可通过编程操作，不仅提高了测定效率及测定结果的准确度和精密度，而且节省了人力物力，因而得到广泛的应用。但还是需要在样品前处理消化过程中使用强酸、强碱，操作复杂、费时，产生二氧化硫等对人体有害且污染环境的酸雾。随着人们环保意识的增强，开始寻求新的检测方法代替凯氏定氮法，近年来杜马斯法在我国也已被标准化，作为饲料原料、谷类豆类、粮食及制品等粗蛋白含量的测定方法[3-6]。但是，由于杜马斯燃烧法需要较高的前期投资，而且人们已经习惯原有的凯氏定氮法，利用杜马斯法测定还没有普及。杜马斯燃烧法的测定原理是将待测样本在纯氧（≥99.99%）环境中高温燃烧，将其所含的有机氮和无机氮全部转化成氮的氧化物后被还原剂还原成氮气。最后，用TCD 检测器检测氮气产量，在短时间内准确地测定出样品的总氮含量。近年来，国内外学者针对凯氏法与杜马斯燃烧法进行了大量的实验，研究结果表明杜马斯燃烧法不仅能够代替凯氏法进行实验室分析，而且准确度和稳定性都优于凯氏法。杜马斯燃烧法前处理简单、省时，能够自动连续大批量检测，具有环境友好、安全等特点，是未来饲料粗蛋白测定的发展趋势。

二、杜马斯燃烧法和凯氏定氮法测定饲料粗蛋白实验方法的比较

Flash2000杜马斯定氮仪（thermo），氦气，二氧化碳（99.99%），氧气（99.99%），氧化剂，吸附剂。

凯氏定氮仪（新嘉），硫酸，盐酸，硼酸，硫酸铜，硫酸钾，氢氧化钠，甲基红，溴甲酚绿。

1.杜马斯燃烧法

开机，稳定后校准。称取30mg样品置于锡箔纸中，并紧密包裹、压实，置于自动落样器内。在高温燃烧管中充分燃烧，产物（NOx）被载气运送至还原炉中，经铜和钨还原生成的氮气除去水后经检测器（TCD）检测，标准曲线计算定量。在仪器中，根据样品的质量和校正曲线形成的检测信号，得出试样中氮元素的含量，粗蛋白含量=总氮含量/样品质量×换算系数。

2.凯氏定氮法

称取2g样品于消化管中，加入催化剂和浓硫酸，在消煮炉中消化至消化液澄清。取出，按照凯氏定氮仪的要求装好40%氢氧化钠溶液、硼酸吸收液、盐酸标准溶液滴定，待溶液由蓝绿色变成灰红色为滴定终点，记录消耗盐酸标准溶液的体积，由此计算样品中粗蛋白的含量。

三、杜马斯燃烧法和凯氏定氮法测定饲料粗蛋白的实验教学比较

凯氏定氮法需要使用浓硫酸和40%氢氧化钠等危险化学试剂，在实验准备及实验进行当中，无论是准备人员还是操作者都不可避免地接触药品，浓硫酸具有高腐蚀性和脱水性，操作不够熟练或者操作失误容易将浓硫酸吸到移液管外面或者吸耳球里，不经意地甩到周围人的衣服上或接触到皮肤上，不久就有可能发现衣服上有破洞或者手指皮肤灼痛。另外由于实验过程中不可避免地将浓硫酸放置在外面，就会存在药品遗失的安全隐患，这给实验室的安全管理造成巨大的压力。

凯氏定氮法测定粗蛋白由于消化过程是在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品，使蛋白质和氨态氮（在一定处理条件下也包括硝态氮）都转变成氨，并被浓硫酸吸收变为硫酸铵；而非含氮物质，则以二氧化碳、水、二氧化硫的气体状态逸出。硫氧化物是大气的主要污染物之一，它不仅危害人体健康，而且还会腐蚀通风设备。如果长期用凯氏法做大量的饲料粗蛋白测定，无疑会对操作人员和环境造成危害。 凯氏定氮法严重的安全问题及环境污染是其自身无法克服的缺陷，如果还是固守原有的凯氏定氮法，与我们向学生传达的环保、健康的理念相悖，与知识的更新、技术的发展是不协调的，随着人们环保意识的逐渐增强，安全、绿色无污染的杜马斯法将得到越来越广泛的应用。

实验室仪器设备是高等学校从事教学、科研的重要物质基础，为了满足新时期饲料企业和畜牧养殖业用人单位对毕业生的需求，本着减少对环境的污染和对实验人员健康的危害的原则，我们有必要摸索杜马斯燃烧法替代原有的凯氏定氮法，这样既能增强学生的学习兴趣，开阔眼界，又能掌握更先进的仪器分析技术。

凯氏法是丹麦科学家Kjeldahl于1883年提出的方法，虽经改進，但由于其前处理步骤多，不同类型的消化设备、蒸馏设备、滴定仪器都会导致测定值间的显著性差异，最快120min/20个（炉），消化两三个小时。杜马斯燃烧法测定操作简单，仪器自动化程度高，测定时间短（测定全过程只需4～6分钟），能够自动连续大批量检测，该方法的重现性明显优于凯氏法。利用高效能的实验仪器吸引学生，尝试开放实验室，可以提高仪器的使用率，使其更好地为教学、科研服务，还有助于学生接触到先进仪器与相关领域前沿科技手段，提高学生的科研能力与综合素质，将实验教学和饲料营养与养殖生产密切结合，以生产实践提高学生的学习兴趣，将课程内容延伸到学生的毕业论文、生产实习中，扩展学生的眼界及解决问题的综合能力。

通过以上的原理及方法介绍，可以看出凯氏定氮法需要有操作娴熟的实验人员才能够胜任，对于初学者或者没有分析化学基础的实验人员容易造成操作失误甚而意外伤害。杜马斯定氮法则不需要专业技巧及知识，操作简单，可以实现快速、全自动。为了提高学生的科研素质，培养综合能力，我们从培养学生良好的学习习惯入手，要求学生实验课前不仅要对实验原理、操作进行预习，带着问题上课，还要借助各种工具了解实验所接触的药品的物理化学性质，使用注意事项。实验过程中不仅知其然，还要知其所以然，出现问题，能够分析原因，排查隐患。这样学生就不仅仅是实验的操作者，而是一名科研工作者，具有维护仪器及实验室安全的责任心。在实验过程中，一接触到仪器就有针对地记录它各方面的数据资料，做好实验记录，出现情况及时解决。

杜马斯燃烧法测定饲料粗蛋白时称样量在0.10～0.15g时，变异系数小，结果稳定；采用标准样品，分别确定杜马斯燃烧法和凯氏定氮法的准确度，两种方法回收率在95.4%～100.1%之间，准确度良好；杜马斯法测定结果的变异系数与凯氏法测定值结果呈显著线性相关（相关系数为0.9988，P﹤0.001），不存在显著差异（P>0.2），结果准确，符合粗蛋白含量分析的要求。两种方法之间的差异主要在测定硝态氮含量较高的饲料原料时，燃烧法的测定值高于凯氏法，可能是由于燃烧法能测出饲料原料中的总氮含量，植物体内的氮主要包括蛋白氮、氨基酸氮、硝态氮和核酸氮，而凯氏法只能测定蛋白氮、氨基酸氮和部分硝态氮。因而杜马斯燃烧法可以作为测定各种饲料粗蛋白的常规方法。

实验教学是学生掌握实验技能的重要途径，利用现有的仪器设备，有助于学生巩固课堂所学的知识，培养动手能力和科研能力。如果实验手段还停滞在瓶瓶罐罐、玻璃仪器范畴，难以调动学生的积极性。仪器设备是高等学校从事教学与科研工作的重要物质基础，将科研用途的杜马斯定氮仪充分利用并投入到实验教学领域，有利于拓展学生视野，掌握科研领域先进的实验手段，正好满足他们渴求新知识新技术的求知欲，他们能够迅速掌握先进的仪器手段，成为生产和科研领域的生力军。在提高仪器的使用率的同时，更好地为教学、科研服务，还有助于培养学生的学习兴趣，提高学生的科研能力与综合素质 。

四、结语

与凯氏法相比，杜马斯燃烧法结果准确、重现性好，前处理简单，时间短，成本低，能够自动连续大批量检测，且避免造成环境污染，适用于饲料样品粗蛋白检测。经过本次尝试，将在科研领域测定饲料粗蛋白的杜马斯燃烧法引入到学生的实验课程里替代原有的凯氏定氮法，以科研促进教学，再将教学成果转化成生产力应用到生产实践当中，将实验教学和饲料生产密切结合，一方面能够以生产实践提高学生的学习兴趣，另一方面将课程内容延伸到学生的生产实践、毕业实习中，进一步加强学生分析问题和解决问题的综合能力。我们还将不断摸索尝试，在传统实验课基础上增添环保、高科技的新实验项目，培养出实验操作技能扎实、具备先进科研素质的新型农业人才，将传统的饲料分析实验课程转变成适应行业发展需求的综合创新型实验课。

参考文献：

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作者简介：朱国霞（1975-），女，硕士研究生，研究方向：水产动物营养。

基金项目： 天津农学院实验教学示范中心教学改革项目2015SY035；

天津农学院高校教师教育改革创新引导发展项目20170210；