Smad4在结直肠癌中的研究进展

宋丹+肖旷+郑勇斌

[摘要] Smad4作为抑癌基因，其编码的Smad4蛋白是转化生长因子β（TGF-β）家族各类信号传导过程中共同需要的介质，调控着细胞的增殖分化与凋亡。据文献报道，Smad4在结直肠癌中扮演重要的角色，其低表达与肿瘤的发展呈负相关。国内外对Smad4在结直肠癌中的表达及其功能的研究有很大进展，本文就目前最新进展进行综述。

[关键词] 结直肠癌；Smad4；抑癌基因；转化生长因子β

[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（b）-0028-04

Research progress of Smad4 in colorectal cancer

SONG Dan XIAO Kuang ZHENG Yongbin▲

Department of Gastrointestinal Surgery， Renmin Hospital of Wuhan University， Wuhan 430060， China

[Abstract] Smad4 protein，encoded by tumor-suppressing gene Smad4， is a signal transduction medium of TGF-βsignaling pathway， regulating the proliferation，differentiation and apoptosis of cells. It is reported that Smad4 plays an important role in colorectal cancer and low expression of Smad4 is negatively related to the colorectal cancer development. This paper mainly review the research progress on the expression and function of Smad4 in colorectal cancer at home and abroad.

[Key words] Colorectal cancer； Smad4； Anti-oncogene； TGF-β

结直肠癌在西方国家一直是最常见的恶性肿瘤疾病之一，近十年来，包括中国、韩国、新加坡在内的许多亚洲国家结直肠癌患病率较之前增长了2～4倍[1]。本文主要回顾Smad4在结直肠癌中的作用。Smad4作为抑癌基因，在结直肠癌中扮演重要的角色，同时，Smad4的低表达与肿瘤的发展呈负相关。Smad4在结直肠癌中的表达及其功能的研究有助于阐明肿瘤侵袭及转移方面的机制，同时在治疗方面将取得更大的突破。

1 Smad4基因的结构功能

Smad4基因位于核染色体18q21.1，核苷酸序列保存在GenBank的U44378中。该基因转录子长2680 bp，其编码的Smad4蛋白由552个氨基酸残基组成。Smad4蛋白是Smads蛋白家族的成员之一，根据其结构与功能分3个亚型：受体活化型（Receptor-activated Smads，R-Smads）、共享型（Common-mediator Smads，Co-Smads）、抑制型（Inhibitory Smads，I-Smads），其中Co-Smads即为Smad4。其一级结构分为3个区：N端区、C端区和中间连接区，N端区和C端区分别称MH1和MH2，中间连接区富含脯氨酸。MH2缺失磷酸化结构SSXS，单独存在不足以行使信号传导功能，只有在部分中间连接区（Smad4的活性区）存在时方可传递信号[2-7]。

2 Smad4基因与TGF-β

转化生长因子β（TGF-β）在细胞增殖、分化、转移以及细胞存活、血管生成、免疫监视过程中是一个普遍存在且非常关键的调节因子。TGF-β信号通路中不同元素突变或删失，以及抗TGF-β调节的抑制性增生常可导致各种肿瘤的发生。尽管TGF-β信号通路普遍被认为具有抑癌作用，但其通过对肿瘤细胞本身以及间质细胞的影响也可促进肿瘤的发生[8]。Sun等[9]在研究中发现，结直肠癌中Smad4的缺失可使TGF-β的抑癌作用转化为促癌作用，但其具体机制有待于进一步研究。

Smads家族蛋白在TGF-β信号通路中具有不可替代性，在将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，且不同的Smad蛋白介导不同的TGF-β家族成员的信号转导。TGF-β作为配体形成的受体复合物，激活Smads进入核内，共同激活或抑制它们调节的靶基因的转录。同时，Smad4作为TGF-β超家族受体的直接底物，对恶性肿瘤的发生、发展及转移具有重要影响。

3 Smad4基因与CRC

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发生发展是一个包括遗传与环境等多因素相互作用的结果。在所有因素中，染色体不稳定性（chromosome instability，CIN）是影響结直肠癌进展的主要通路之一，其中主要包括APC、p53和DCC/Smad4等的缺失[10]。特别是Smad4在结直肠癌发生发展过程中的抑癌机制不可忽视，因此，探索Smad4基因对于结直肠癌的诊断及治疗均有重要的作用。

3.1 Smad4与CRC的发生及发展

抑癌基因Smad4是TGF-β信号通路中重要的转录因子，在结直肠癌等消化道肿瘤中常常发生基因变异，包括染色体片段丢失、基因突变以及基因的表达异常。Demagny等[11]发现Smad4 Pro130Ser与Asn351His的突变可加强糖原合成酶激酶-3（GSK-3）的磷酸化，从而抑制Smad4的活性及稳定性，同时GSK-3活性被抑制可恢复细胞中TGF-β信号，说明抑癌基因Smad4的点突变可通过GSK-3的磷酸化作用从而可逆地使TGF-β信号失活。阐明了Smad4在TGF-β信号通路中的作用，同时提示GSK-3抑制剂可提高Smad4点突变蛋白的稳定性，并恢复有类似突变癌细胞的TGF-β正常信号，为出现一种新的治疗方式提供可能。Inamoto等[12]对333例早期结直肠癌标本的研究以及在原位异种移植模型上探讨Smad4缺失与肿瘤生长的关系，发现Smad4缺失的CRC细胞分泌的趋化因子（CCL15）可募集趋化因子受体（CCR1）+的细胞，导致早期肿瘤出现侵袭性生长。免疫组化结果表明Smad4与CCL15的表达显著相关，在CRC入侵之前，分泌CCL15+的早期CRC细胞所募集的CCR1+的细胞大约是分泌CCL15-的2.2倍。重要的是，这些CCR1+的细胞主要是骨髓来源的抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）（CD11b+、CD33+、HLA-DR-）。大多数CCR1+细胞表现为粒细胞样的MDSC（CD14+），也有部分为单核细胞样的MDSC（CD14+）。同时，研究中发现CRC患者血清CCL15水平显著高于对照组。据此，阻断MDSCsCCR1+的募集可能是一种新奇的分子靶向治疗方法，血清CCL15的浓度也可作为CRC新的生物标志物。Voorneveld等[13]在细胞水平及动物模型上对BMP信号通路与Smad4的关系的研究发现，激活Smad4缺失细胞的BMP信号通路能改变标志上皮间质转化过程的蛋白及mRNA水平，并能增加细胞的转移与侵袭能力以及细胞伪足的形成。体外敲出Smad4缺失细胞的BMP受体可降低其侵袭能力，因此发现Smad4缺失与患者不良预后的这种关系依赖于BMP受体的表达而非TGF-β受体的表达，因此寻求一种干扰非依赖Smad4的BMP信号通路的药物可作为治疗CRC的新手段。近年来，关于microRNA在肿瘤发生发展中潜在作用的探究越来越成为热点，为了阐明CRC患者中microRNA-130a/301a/454家族与samd4之间的关系，Liu等[14]研究发现相比于邻近正常黏膜，CRC组织中microRNA-130a/301a/454家族被上调。在CRC HCT116与SW480细胞中，microRNA-130a/301a/454可增强细胞的增殖与转移能力，同时发现关于miRNAs的抑制因素与细胞的生存状况关系密切。值得注意的是，microRNA-130a/301a/454在CRC细胞中的生物学功能是通过抑制Smad4来调节的，在人CRC中，microRNA-130a/301a/454的上调与Smad4的下调相联系。除此以外，Cheng等[15]通过转染等各种技术研究发现，在人CRC细胞中，miR-20a-5p通过调节Smad4基因的3′UTR也可使Smad4蛋白表达降低。miR-20a-5p不仅可以增强CRC细胞在体外的增值能力及在体的肝转移能力，还可以通过下调Smad4的表达促进上皮间质转化。同时，通过对544例CRC患者标本的组织微阵列分析发现，miR-20a-5p在人CRC组织中表达上调，特别是在转移组织中。高水平miR-20a-5p被证实预示CRC患者的不良预后。

Smad4缺失即为微卫星不稳定性（MSI）较为典型的情况，早有学者提出MSI是肿瘤形成的机制之一[16]，Isaksson-Mettavainio等[17]研究了Smad4的表达量对MSI型CRC患者预后的影响，发现Smad4的高表达可以明显提高MSI型CRC患者的生存率。据文献报导，Smad通路与非Smad通路还存在相互调控作用，张梅庆等[18]通过对53 例临床病理标本的免疫组化分析，探讨Smad与蛋白激酶B（PKB）通路的相关性，发现Smad4 表达下降还可能通过激活PKB通路促进CRC的进展，但其具体机制还有待于进一步阐明。

在肿瘤生长过程中，肿瘤组织本身的营养供给状况在肿瘤的发展中占有主要地位，在对肿瘤组织的血管及淋巴管生成的研究中， Yang等[19]发现PSG9/Smad4复合体可募集细胞质中Smad2/3使其成为复合体，从而促进Smad4在胞核中滞留，PSG9/Smad4复合体还可增强与血管生成相关的多重基因（IGFBP-3，PDGF-AA，GM-CSF，和VEGFA）的表达。另外通过对140例CRC患者与125例正常组的血清PSG9水平的对比以及对74组肿瘤组织及其相邻正常组织PSG9水平的检测发现，CRC患者的血清及腫瘤组织中，PSG9都显著升高。且其升高水平与患者预后及微脉管密度负相关。体外研究证实PSG9的过表达明显促进HCT-116与HT-29细胞的增值与转移，同时，PSG9的水平降低可抑制SW-480细胞的增殖。通过在人脐血管内皮细胞上研究促血管发生实验证实PSG9还可促进血管生成。其后的免疫共沉淀实验证明了PSG9与Smad4的这一相关性。Smad4作为TGF-β信号通路中重要的下游调节因子，对CRC的抑癌作用明显，但其对CRC的淋巴管生成影响一直未明。Liu等[20]研究了Smad4对淋巴管生成的潜在抑制作用以及在结肠癌中与VEGF-C分泌的相关性。发现，Smad4可抑制VEGF-C的分泌，并抑制淋巴管的生成，从而降低肿瘤的转移及侵袭能力。

3.2 Smad4与CRC的转移

早前Tian等[21]在体外细胞水平上发现高表达Smad4的sw480癌细胞株在培养过程中细胞迁移率明显减少，而近十年来，国内外出现了较多对Smad4缺失在CRC转移中具体机制的探讨。Itatani等[22]通过对人CRC细胞中Smad4调节CCL15表达的能力的研究以及对141例CRC肝转移标本的研究发现，在人CRC细胞中，Smad4的缺失不仅可以上调CCL15的表达，而且在表达CCL15的肝转移组织中含有更高水平的CCR1+细胞，这些发生肝转移的病人出现更低的生存率。提示可以阻断CCL15募集CCR1+细胞的药物来防止CRC的肝转移。Yamamoto等[23]对小鼠模型的研究以及对107例CRC肺转移临床标本的检测发现，缺失Smad4可通过CCL15-CCR1轴积累CCR1+肿瘤相关中性粒细胞来促进CRC细胞的肺转移能力。同时根据刘岩青等[24]对112例CRC患者的最新临床研究以及陈小会等[25]对99例CRC患者的临床标本的研究发现，CRC中Smad4低表达与肝转移相关，且是CRC肝转移的独立影响因素，可作为预测CRC肝转移的生物学指标。

3.3 Smad4与CRC患者的预后

目前，CRC患者的预后主要根据临床病理分期判定，这对预后的评价的合理性有待于提高，因此越来越多的研究从分子机制层面探讨某些分子标志物与患者预后的关系。其中，Smad4基因在CRC预后方面的研究一直是科研中的热点，为了证明Smad4的表达情况与CRC患者结局是否相关，Kozak等[26]在2005～2009年连续收集了241例CRC患者的标本及其临床病理记录，对其癌组织及其正常组织通过微阵列进行分析，并通过免疫组化检测Smad4的表达情况。结果241例肿瘤中有21例Smad4表达阴性。后期对患者的跟踪调查进一步发现，Smad4阴性相对于Smad4阳性患者有着不良预后。早前Voorneveld等[27]对137个文献的数据归纳分析也进一步证明，免疫组化检测Smad4表达情况可作为患者预后情况的标志。传统医疗过程中，常以临床病理结果来评价CRC肝转移切除术后的复发率，其预后与相关的分子标记物的关系并不清楚，López-Gómez等[28]对121例患者进行研究后发现，Smad4和TS的表达情况与CRC肝转移切除术后的复发风险相关，此发现有利于更科学的弥补在以临床病理为基础的评价体系中的不足。Wang等[29]通过免疫组化及微阵列对112例标本进行分析发现，COUP-TF Ⅱ的高表达与Smad4阴性均提示CRC患者的不良预后。Chun等[30]通过对201例直肠癌（三期）标本通过免疫组化检测了TGF-β1、TGF-βⅡ型受体，Smad3、Smad4以及Smad7蛋白的表达，结果发现TGF-β1低表达与患者的不良预后相关。王星权等[31]对134例CRC患者的跟踪调查发现，CRC组织中具有Smad4高表达的患者，其术后总体生存期较低表达组患者为好。Smad4缺失不仅影响CRC的发生发展转移及预后，同时影响着CRC的化疗效果，Zhang等[32]研究发现了Smad4调节5-FU的化疗敏感性的新机制，即通过抑制PI3K/Akt/CDC2/凋亡抑制蛋白级联反应阻碍细胞周期。最近相关研究也证明LY294002逆转Smad4低表达的CRC患者的化疗敏感性的潜在疗效。因而关于这方面的研究将有利于提高CRC患者的预后。以上均提示，Smad4的缺失预示着患者的不良预后，所以Smad4蛋白有望作为评价CRC患者预后的重要蛋白标志物。

4 展望

目前，Samd4在肿瘤发生发展及转移过程中的分子生物学方面的研究还在不断深入，同时Smad4作为CRC患者评价预后的分子标志物越来越得到大家的认可。但目前尚缺乏一个Smad4缺失并模拟人体散发性癌灶的CRC动物模型，从而更详尽地研究Smad4在CRC发生发展及转移中的机制，以及在肿瘤发生发展的整个过程中，Smad4与肿瘤局部免疫状况的关系及其在致瘤中的地位，因此有待于进一步研究。

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（收稿日期：2017-03-27 本文编辑：李岳泽）