稀土开采对土壤细菌群落组成与多样性的影响

王友生,侯晓龙,蔡丽平,马祥庆*



稀土开采对土壤细菌群落组成与多样性的影响

王友生1,2,侯晓龙1,蔡丽平1,马祥庆1*

(1.福建农林大学林学院,福建福州 350002；2.福建省龙岩市林业科学研究所,福建龙岩 364000)

为探索稀土开采对土壤生态系统的影响,以长汀离子型稀土矿开采废弃地为研究对象,通过采集稀土开采前、开采后的取土场和堆浸池的土壤,通过提取土壤DNA后,利用Illumina Miseq高通量测序平台进行细菌的16S rDNA测序,分析以上3个作业区土壤细菌OTU组成,并以此为基础进行物种注释、多样性和系统发育树分析.研究结果表明:稀土开采后的取土场和堆浸池比开采前土壤细菌群落多样性以及各类群组成丰度比例发生显著变化,但土壤细菌的优势种群不变,分别从门、纲、目、科、属水平鉴定的优势种为:厚壁菌(门)、芽孢杆菌(纲)、乳杆菌(目)、肠球菌(科)、肠球菌(属),系统发育树显示厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、疣微菌门、酸杆菌门、硝化螺旋菌门、蓝藻门、在系统发育上有一定的亲缘关系.

稀土；土壤细菌；16S rDNA；群落；多样性；系统发育树

随着全球经济的快速发展,对矿产资源的消耗急剧上升[1].然而,矿山开采极易造成土壤扰动[2]、植被破坏、环境污染、生态恶化等[3-5]一系列问题,这已成为当今世界各国环境问题的重要组成部分[6-7].稀土作为全球重要的矿产资源,广泛应用于军事、工业等领域[8],需求量日趋增加[9].中国的稀土资源丰富,享有“稀土王国”称号,特别是位于福建省长汀县的稀土资源储量很大.近年来随着稀土价格的不断攀升,长汀县的稀土矿资源在短时间内被大量开采,由此造成土壤生态系统的破坏问题一直是人们关注的焦点.微生物是土壤生态系统的重要组成部分,在土壤生态系统中扮演重要角色,它们参与了土壤结构的形成[10],直接影响着土壤生态系统的稳定性和土壤肥力[11].细菌作为森林土壤微生物的最主要类群,其群落的变化可以先于土壤物理化学性质的变化做出响应,从而较早地揭示土壤生态环境的演变[12].已有研究表明矿区废弃地特殊的环境分布着特有的细菌种类,且在复垦与植被恢复后土壤细菌群落多样性及其组成也会随之作出响应[13].另外,矿区土壤微生物的研究对矿区的生态恢复和微生物浸矿等领域具有一定的应用价值[14].因此,矿山废弃地土壤细菌群落特征及其多样性的研究成为环境科学界研究的热点[15].

国内外在土壤细菌方面已开展了大量研究,其主要采用培养法,但培养法存在较多局限性,不能全面客观地反映细菌的群落特征.近年来,随着分子生物学的发展,16s rDNA测序技术在土壤细菌群落组成与多样性研究上得到了广泛应用[16-17],使得不可培养细菌的检测成为可能,突破了传统涂抹培养法对细菌种类分析的局限性[18].新技术的应用,使大量未知的微生物物种及其功能得到鉴定[19-20],土壤微生物群落结构多样性获得深入探明[21-22],各物种间的系统发育关系得到进一步揭示[23-24],植物-微生物-土壤之间相互作用机制的研究正不断推进[25].

但目前国内外关于采矿作业对土壤细菌群落生态方面的影响研究甚少,特别在离子型稀土矿区土壤细菌方面的研究更少.堆浸生产是目前长汀离子型稀土矿开采的主要方法之一,是从取土场挖取土壤运送到堆浸池后,用酸性硫酸铵淋洗,再用清水淋洗提取稀土,最后被遗弃的土壤,形成废弃堆浸池[26].因此稀土开采废弃地主要由取土场与堆浸池构成.鉴于此,本文以长汀红壤区离子型稀土矿采矿前以及开采后形成的取土场和堆浸池为研究对象,在分析土壤理化性质基础上,通过第三代misequ高通量测序平台对不同采样区土壤细菌进行16s rDNA测序,分析开采前后不同作业区土壤细菌在各分类水平上的种群多样性及其差异,揭示稀土开采对土壤细菌群落影响的内在机制,为稀土矿废弃地的生态恢复和土壤微生物生态学研究提供科学依据.

1 试验地概况

表1 稀土开采前后的土壤物理性质

注:小写字母表示0.05水平LSD多重比较结果,下同.

表2 稀土开采前后的土壤化学性质

试验地位于福建省长汀县河田镇(25°42′N, 116°86′E),海拔316m年平均气温17.5~18.8℃,极端最高气温38.9℃,极端最低气温-4.9℃,年平均降水量1737.1mm,年日照时数1924.6h,无霜期平均260d,土壤为粗晶花岗岩发育的砂壤土,极易造成水土流失.稀土开采前后土壤的理化性质见表1和表2[27].

长汀县采用堆浸工艺生产稀土,形成的稀土开采废弃地有两种类型:取土场与废弃堆浸地.取土场是表层土壤被挖取后剩余的裸地.废弃堆浸地是从取土场挖取含稀土土壤运送到简易堆浸池后,用2%硫酸铵反复淋洗,再用清水反复淋洗提取稀土,最后被遗弃的土壤,废弃堆浸池面积500m2.

2 材料与方法

2.1 土壤取样

2015年8月,在长汀稀土废弃地的简易堆积池、取土场及其周边未开采地上采样(图1).分别布设10个10m×10m样方,在每个样方内按梅花型布点,用经过高温灭菌的组培瓶采集0~20cm的土样5个,共取土壤样品150个.同一采样区的土样在超净工作台上挑出砂砾与植物根系并混合均匀,取300g用干冰保存,用于土壤细菌16S rDNA测序.

2.2 土壤DNA提取与16S rDNA扩增

采用Fast DNAâSPN Kit for Soil试剂盒(Bio 101,Vista,CA,USA)和Fast Prep FP220核酸提取仪提取,用荧光计测定提取液中双链DNA浓度,用琼脂凝胶电泳(琼脂凝胶浓度:1%,电压:150V,电泳时间:40min)测定DNA完整性.然后以此DNA为模板,对16S rDNA V4可变区进行PCR扩增,扩增引物为515F-806R,PCR预混液采用NEB Phusion High-Fidelity PCR Master

Mix.PCR反应体系如下:30ng DNA、4μL引物、25μL PCR预混液,用超纯水补充至50μl.PCR反应条件如下:98℃预变性3min,98℃变性45s, 55℃退火45s,72℃延伸45s,30个循环后72℃延伸7min,最后保持在4℃环境下.

3 结果与讨论

3.1 稀土开采对土壤细菌多样性的影响

从土壤细菌多样性指数(表3)可看出,3个作业区样品的测序深度指数Coverage(Good’s nonparametric coverage estimator)均在0.8左右,表明测序结果可以反映样品的实际情况.采矿后堆浸池与取土场土壤的observed species指数(Sobs)、chao1指数(chao1-based coverage estimator)、ACE指数(abundance-based coverage estimator)均显著大于采矿前对照,说明稀土开采后土壤细菌丰度显著提高.shannon指数(nonparametric Shannon diversity index)显著大于采矿前对照,而simpson指数(nonparametric Shannon diversity index)则显著小于采矿前对照(<0.05),说明稀土开采后土壤细菌群落的多样性显著提高.

土壤细菌群落组成与多样性受土壤重金属含量、理化性质、地下食物链、地表植物组成、人为干扰等因素的影响[28],长汀稀土矿开采后土壤细菌多样性指数上升,其原因一方面是由于长汀稀土主要分布在强度水土流失区,由于长期来的植被破坏,植被稀少且盖度低,对土壤微生物的影响有限;另一方面可能是由于长汀稀土采矿前土壤稀土含量较高[29],土壤微生物受到抑制,而采矿后形成的取土场与堆浸池稀土含量较少,低浓度的稀土对土壤细菌的代谢有刺激作用[30-31].从取土场与堆浸之间的多样性指数比较可看出,取土场土壤细菌多样性高于堆浸池,一方面可能是堆浸池里残留的酸性提取液对土壤pH值的影响,在酸性环境下重金属得到活化,不利于土壤细菌的生存,从而降低土壤细菌的种类与数量,另外高浓度浸提剂(硫酸铵)对土壤微生物也存在抑制效应[30];另一方面可能是长汀稀土矿属风化壳离子型,矿体主要分布在土层10m以上[32],取土场多为10m以下的下层土,稀土含量较低,且经多年荒废后表层土壤水热条件得到改善,促进土壤细菌的繁衍与生存.

3.2 稀土开采对土壤细菌群落组成的影响

在97%相似度情况下,OTU与NCBI Greengene数据库比对结果发现,样品可以在门、纲、目、科、属这五个分类水平上进行物种注释,分类结果显示3个作业区在门、纲、目、科、属水平上的主要群落组成相同,即采矿前、取土场、堆浸池在门水平上厚壁菌门分别占98.64%, 95.57%,71.57%;在纲水平上芽孢杆菌纲分别占98.34%,95.11%,71.38%;在目水平上乳杆菌目分别占90.32%.85.00%.64.80%;在科水平上肠球菌科分别占89.20%,82.93%,64.12%;在属水平上肠球菌属分别占89.20%,82.93%,64.12%.

金属矿区常发现有特定的细菌类群[14],稀土矿开采前的土壤中发现有1个特有的门(梭菌门);在门分类水平上堆浸池有2个特有的类群,分别为绿菌门、WS3;取土场有5个特有的门,分别是GAL15,GN02,OP3,TM7,Thermi.取土场的细菌种类较丰富,有1个特有的纲(Synechococcophycideae),2个特有的目(纤细杆菌目、Pseudanabaenales),1个特有的科(纤细杆菌科).在3个作业区土壤中均鉴定出相对丰度>0.5%的2株细菌,一株为类芽孢杆菌,另一株为蜡样芽孢杆菌.这些细菌在稀土矿区土壤修复及稀土浸提领域中可能存在一定的应用价值.

从属分类水平上的绝对丰度发现各种细菌数量均表现为:QTC>DJC>BM,其中>104个的细菌仅为肠球菌属,其在稀土开采后呈下降趋势. 芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属的数量介于103~104之间,二者在稀土开采后呈上升趋势.中量(102~103)细菌中除、在取土场中下降,藤黄单胞菌属、伯克氏菌属、、甲基杆菌属、红游动菌属、慢生根瘤菌属、出芽菌属、嗜碱菌属、、、在稀土开采后的两类废弃地中呈不同程度上升.微量(10~102)与痕量(<10)细菌在3个采样区的细菌物种丰度皆最大,分别分布37、59属.

土壤养分对土壤细菌的栖息具强烈影响,养分贫瘠的土壤中酸杆菌门分支的细菌具有更强的竞争能力,长汀稀土开采后取土场、堆浸池土壤有机质显著下降,土壤酸杆菌呈不同程度的增加,这与Smit等[33]的结论相一致.

一般而言,酸杆菌与变形菌是森林土壤细菌的优势菌群,长汀稀土开采对土壤细菌种群的分布产生了显著影响,从门分类水平上看,稀土矿区各作业区的土壤优势菌群均为厚壁菌,一方面可能与稀土矿区土壤含有稀土及镉、铅等重金属有关[26];另一方面,可能与稀土开采前后土壤理化发生了显著变化,但养分仍处于贫瘠水平,结构仍然是以砂砾含量较高的砂壤土有关;当然,也可能与土壤细菌各种群间存在共生或拮抗关系[14],使得种群处于特定的平衡状态有关.王建宏[34]在外源稀土积累的尾矿坝研究中也发现类似的结论.

表3 稀土开采前后土壤细菌α多样性

3.3 群落相似性分析

从群落相似性Jacacard指数(表4)可看出,取土场与采矿前、堆浸池与采矿前、取土场与堆浸池的土壤细菌群落相似性指数均小于0.3,均处极不相似水平,说明稀土开采对土壤细菌种群结构产生了极显著的影响,且开采后形成的两类废弃地土壤细菌群落存在极显著差异.

表4 各群落间Jaccard指数

3.4 稀土矿区土壤微生物种群进化分析

为了进一步了解稀土矿区土壤细菌物种间的进化关系,选择一条丰度最高的序列分析其在属水平上构建物种系统进化树.这条序列中包含115个属,分别对应于12个门,具体如下:

1)变形菌门由55属组成,其中-变形菌亚门由20属组成,分别为:中慢生根瘤菌属、、土微菌属、生丝微菌属、苍白杆菌属、、甲基杆菌属、苯甲基杆菌属、短波单胞菌属、柄杆菌属、红游动菌属、慢生根瘤菌属、黄色杆菌属、拜叶林克氏菌属、、赤杆菌属、新鞘脂菌属、、、鞘脂单胞菌属、副球菌属、、、红杆菌属、氨基杆菌属、葡糖杆菌属、玫瑰球菌属;γ-变形菌亚门由25属组成,分别为:立克次氏小体属、、蛭弧菌属、厌氧粘细菌属、单胞菌属、、热单胞菌属、寡养单胞菌菌、溶杆菌属、独岛菌属、纤维弧菌属、希万氏菌属、沙雷氏菌属、弧菌属、盐弧菌属、不动杆菌属、水栖菌属、嗜血菌属、、硫杆状菌属、伯克氏菌属、、假单胞菌属、、.

2)厚壁菌门由18属组成,分别为:嗜碱菌属、、、、梭菌属、颤螺旋菌属、P-75-a5、链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属、

、肉食杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、短芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属.

3)放线菌门由14属组成,分别为:、节细菌属、、纤维菌属、、壤霉菌属、假诺卡氏菌属、拟无枝酸菌属、棒状杆菌属、分支杆菌属、类诺卡氏菌属、马杜拉放线菌属、.

4)拟杆菌门由12属组成,分别为:、鞘脂杆菌属、、螺状菌属、、黄杆菌属、金黄杆菌属、普氏菌属、、拟杆菌属、.

5)疣微菌门由5 属组成,分别为:Ellin506、DA101、Chthoniobacter、Candidatus Xiphinematobacter、丰祐菌属.

)浮霉菌门由4属组成,分别为:出芽菌属、小梨形菌属、、浮霉状菌属.

7)酸杆菌门由3属组成,分别为:Candidatus Koribacter、Terriglobus、Candidatus Solibacter.

8)硝化螺旋菌门由2属组成,分别为:硝化螺旋菌属、JG37-AG-70.

9)衣原体门仅由Candidatus Protochla组成.

10)异常球菌-栖热菌门仅由异常球菌属组成.

11)蓝藻门仅由瘦鞘丝藻属组成.

12)梭菌门仅由纤毛菌属组成.

3.5 优势细菌与土壤环境的冗余分析

从图2可看出,厚壁菌与总氮的相关性最大,但也与有效磷、全钾、有机质、全磷、pH值存在正相关,与水解性氮、有效钾、容重、>0.25mm水稳定团聚体呈负相关;变形菌则与>0.25mm水稳定团聚体相关性最大,同时也受pH值、容重、全磷、有效钾的影响,水解性氮、有机质、全钾、有效磷、全氮对变形菌活性有一定的抑制作用.

长汀稀土开采后的两类废弃地土壤最大持水量、最小持水量、毛管持水量、非毛管孔隙、毛管孔隙均显著下降,土壤细菌多样性皆增加,这可能是由于土壤水分物理性质改变,加大了土壤的异质性,从而增加土壤微生物多样性,这与Zhou等[35]的研究结论相一致.

已有研究表明土壤团粒结构与土壤细菌的分布呈密切相关,长汀稀土开采后取土场土壤的团粒结构发生显著变化,主要表现为大颗粒(>5mm)的比例显著增加,堆浸池则未发现显著变化.从门分类水平上看,堆浸池土壤变形菌相对丰度增加,可见变形菌在大颗粒的砂质土壤中具较大丰度,这与陈香碧等[28]的研究结论相一致.

有研究表明土壤pH值对土壤细菌的丰度呈正相关,稀土矿区开采前后pH值发生显著变化,土壤优势细菌的丰度也发现类似规律.

ρb、AS、TN、TK、TP、AN、AP、AK、OM、pH分别代表容重、>0.25mm水稳定团聚体、全氮、全钾、全磷、碱解性氮、有效磷、有效钾、有机质、酸碱度

RDA分析结果表明变形菌门主要受土壤有机质、全氮、有效磷、速效钾的影响,这与黎宁等[36]的结论一致.在属分类水平上看,长汀稀土矿开采前后的土壤中均含有6个属的细菌,但李兆龙在广东和平县的稀土矿研究中发现采矿前有两个属的细菌,但采矿后仅发现有一个属的细菌.这与本研究结果差异较大,其原因一方面可能与研究区域土壤理化性质及气候差异有关[37],另一方面可能与不同矿区稀土含量的差异,从而影响土壤细菌类群的生存有关[38].

4 结论

4.1 长汀离子型稀土矿开采后,形成的取土场与堆浸池废弃地土壤理化性质发生显著变化导致土壤细菌群落结构发生显著变化,其丰度与多样性均比对照地显著提高.

4.2 稀土开采后土壤细菌优势物种未发生显著变化,从门、纲、目、科、属分别鉴定为厚壁菌(门)、芽孢杆菌(纲)、乳杆菌(目)、肠球菌(科)、肠球菌(属).

4.3 稀土矿3个作业区土壤中均鉴定出相对丰度>0.5%的2株细菌,一株为类芽孢杆菌,另一株为蜡样芽孢杆菌.

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致谢：本试验的外业采样工作得到福建省长汀县水土保持站彭绍云等同志的大力协助,在此表示衷心的感谢.

Impacts of rare earth mining on soil bacterial community composition and biodiversity.

WANG You-sheng1,2, HOU Xiao-long1, CAI Li-ping1, MA Xiang-qing1*

(1.Forest College of Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China；2.Longyan Forestry Science Institute of Fujian Province, Longyan 364000)., 2017,37(8)：3089~3095

Experiment was designed examine impacts of rare earth mining on soil ecosystem health in Changting. Soil samples were taken from depths of 0~20cm in pre- and post-mined areas (rented earth pits, heap-leaching mine area). Microbial DNA was extracted from soil samples and then 16S rDNA gene sequencing was carried out using Illumina MiSeq equipment. Examination of bacteria species present showed the microbial population was dominated by the level of phylum, class, order, families and genus and these were Firmicutes, Bacilli, Lactobacillales, Enterococcaceae,. The phylogenetic tree showed there were certain genetic relationships among Firmicutes, Proteobacteria, Actinobactera, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Acidobacteria, Nitrospirae, Cyanobacteria, Thermi. Alpha diversity index was calculated based on operational taxonomic units (OTUs). Results indicated that soil bacterial diversity and taxonomic composition distribution changed significantly in post-mining areas compared to control areas. However, the predominant bacteria in the soil communities did not change.

rare earth；soil bacteria；16S rDNA；community；diversity；phylogenetic tree

X17

A

1000-6923(2017)08-3089-07

王友生(1981-),男,福建永泰人,福建农林大学博士研究生,主要从事退化生态系统恢复与重建研究.

2017-03-21

国家科技支撑计划项目(2014BAD15B02)国家公益性行业科研专项(201111020–2);福建省产学合作科技重大项目(2013N5002);国家林业局林业公益性行业科研项目(201304303);

* 责任作者, 教授, lxymxq@126.com