不同矿物成因禹余粮矿物成分分析及止血作用研究

2017-08-30 00:36吴超颖刘圣金房方王宇华杨文国
中国中药杂志 2017年15期
关键词:止血

吴超颖+刘圣金+房方+王宇华+杨文国+马瑜璐+吴德康

[摘要]小鼠采用华法林钠造模,用断尾法和玻片法分别测定出血时间和止血时间,大鼠连续15 d给药测定血浆复钙时间、血浆黏度、血小板黏附率、血小板聚集率等血液指标。 与空白组比较,模型组能延长(P<005)出血时间,与模型组相比阳性维生素K、淋滤浸染型水煎液和沉积型水煎液能显著(P<001)缩短出血时间,阳性维生素K能显著(P<001)缩短凝血时间,淋滤浸染型水煎液、沉积型水煎液和沉积型粉末可(P<005)缩短凝血时间。与空白组比较,淋滤浸染型水煎液低剂量、中剂量和粉末中剂量,以及沉积型水煎液高剂量和药渣低剂量都可降低血浆黏度(P<005),淋滤浸染型粉末高剂量和沉积型水煎液低剂量能显著降低(P<005)血浆黏度。与空白组比较,禹余粮淋滤浸染型水煎液高剂量组能显著降低(P<005)血小板黏附率,沉积型水煎液高能显著增加(P<005)血小板黏附率,淋滤浸染型水煎液高剂量、药渣高剂量和淋滤浸染型粉末低剂量、药渣低剂量能降低(P<005)血小板聚集率,沉积型水煎液高剂量、粉末高剂量能增加(P<005)血小板聚集率。矿物成分分析利用偏光显微镜及X射线衍射(Xray diffraction,XRD)法。 2种矿物成因禹余粮矿物组成均含针鐵矿、石英、高岭石,沉积型尚含伊利石、钠长石。研究结果表明沉积型成因的禹余粮止血作用较好,可能与针铁矿、伊利石含量较高有关。

[关键词]矿物药; 禹余粮; 矿物成因; 止血; 凝血; 矿物成分

Mineral composition analysis and hemostatic

effect of limonitum with different mineral genesis

WU Chaoying, LIU Shengjin, FANG Fang, WANG Yuhua, YANG Wenguo, MA Yulu, WU Dekang*

(Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, National and Local Collaborative

Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, State Administration of

traditional Chinese medicine Key Laboratory of Chinese Medicine Resource Recycling Utilization, Jiangsu Key Laboratory for

Functional Substance of Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

[Abstract]Models were established in mice with warfarin sodium method, and their bleeding time and hemostasis time were measured by tail cutting method and slide method respectively Rats were administered for 15 consecutive days to measure their recalcification time, plasma viscosity, platelet adhesion rate, platelet aggregation rate and other blood indexes As compared with the blank group, the bleeding time was prolonged in model groupn(P<005) As compared with the model group, the results showed that the positive vitamin K, the leaching type water decoction and the sediment type decoction could significantly shorten the bleeding time (P<001); positive vitamin K significantly (P<001) shortened clotting time, and the leaching type water decoction, the sediment type water decoction and the sediment type powder could also shorten the clotting time (P<005) As compared with blank group, low dose, medium dose of leaching type water decoction, medium dose of powder, high dose of sediment type decoction and low dose of drug residues could reduce plasma viscosity (P<005), and high dose of leaching powder and low dose of water decoction could significantly reduce (P<001) plasma viscosity As compared with blank group, Limonitum leaching type decoction high dose group could significantly reduce the platelet adhesion rate (P<005), while sediment type water decoction could significantly increase the platelet adhesion rate (P<005); the high dose of leaching type water decoction, high dose of drug residues, low dose of leaching type powder and low dose of drug residues could decrease the platelet aggregation rate (P<005), while high dose of leaching type water decoction and high dose of the powder could increase the platelet aggregation rate (P<005) Analysis of mineral compositions was conducted by polarized light microscopy and Xray diffraction (XRD) The results of the both methods showed that Limonitum mineral compositions contained goethite, quartz, and kaolinite, and sedimentary type also contained illite and albite Sediment type of Limonitum showed better hemostatic effect, which may be related to the high content of goethite and illite.

[Key words]mineral Chinese medicine; limonitum; mineral genesis; hemostasis; coagulation; mineral composition

禹余粮Limonitum又称余粮石,为临床常用矿物药,始载于《神农本草经》,被列为上品,为氢氧化物类矿物褐铁矿,主含碱式氧化铁[FeO(OH)],具有涩肠止泻,收敛止血的功效,主治久泻久痢、大便出血及崩漏带下等症[1]。禹余粮现代研究较少,研究内容主要涉及药材鉴定、炮制及无机元素(含价态)分析等[28],对禹余粮止血作用研究报道较少。课题组前期实验研究表明,生品禹粮石有较好的止血作用,煅品及醋品虽能延期小鼠凝血时间,但与对照组比较无显著性差异,说明对小鼠凝血时间无明显影响[9]。本文止血作用研究以禹余粮生品为主要研究对象。

药用矿物资源主要由无机化合物组成,在自然地质作用中形成,多数是一种或几种矿物的集合体或聚集体,很少是单个的晶体。药用矿物资源可在各种地质作用中形成,而同一种矿物药资源也可在多种地质作用中形成。一般用成因类型来概括一个地质作用的某一段历程所形成的药用矿物及其相应的特点,矿物成因主要与岩浆活动、变质作用及表生作用有关[10]。

在自然界中,作为禹余粮药用的褐铁矿有多种成因类型,主要矿物成因与表生作用相关。一种成因为风化型中的淋积亚型(淋滤浸染型),即原发型结核禹余粮,为含铁的原生矿物风化后,多沿异地的矿物或岩石的层理、裂隙、颗粒间隙等处淋滤浸染,呈现紫褐色脉状充填于均质混合岩裂隙中,常常保留有原来岩石或矿物的层理构造、砂粒结构及裂隙条带特征。另一种成因是沉积(胶态)型,淋滤迁移的凝胶若进行交代沉积,在富水介质中,被溶解的物质形成有不同电荷的胶粒,如Fe2O3,Al2O3等形成带正电荷的胶粒,SiO2,MnO2等黏土矿物质形成带负电荷胶粒,不同电荷的胶粒聚集形成具有同心环状构造的卵形结核体,经氧化、脱水等作用,形成了常见的禹余粮形态。以气泡或水滴为核心凝聚加大者,为空心结核体,其内部包裹了一定的水分,天长日久,即形成了褐铁矿粉末,多具胶态结核,同心圆状,肾状,钟乳状结构及壳层、块状构造。由于褐铁矿本身成分的复杂性和铁化合物的不完全转化,在凝胶物质沉淀过程中,就可能形成层叠状结构。此外,禹余粮尚有与岩浆活动有关的热液蚀变型等矿物成因[1112]。

不同矿物成因的禹余粮,其成分、形态、结构构造、药理作用及药用价值也不尽相同。本文对目前市场主要流通的淋滤浸染型、沉积型2种不同矿物成因的禹余粮进行成分组成及止血作用差异性研究,为禹余粮优质矿产资源的筛选及其进一步开发利用、深入研究奠定基础。

1材料

11仪器

日本理学D/MaxRa型X射线衍射仪;B100V7型血液流变仪(重庆开发有限公司);LBYNT型血小板聚集仪(北京普利生科技有限公司);PUN2048B普朗医疗凝血仪;恒温培养箱Binder F115;酶标仪TECANF50。

12试剂与药品

华法林钠片(批号18151204E,上海信谊九福药业有限公司);维生素K注射液(215010611,山东益康药业股份有限公司);羧甲基纤维素钠(CMCNa)、水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)。

沉积型禹余粮样品采自河南南阳市栾川县伏牛山一带(批号20160507),淋滤浸染型禹余粮样品购自河南禹州市银泉药材站(批号20160510),产地为河南禹州,经南京中医药大学吴德康教授鉴定均为矿物药禹余粮,矿物成因由南京大学地球科学与工程学院胡文瑄教授鉴定,样品保存于南京中医药大学中药鉴定学教研室。

13实验动物

SPF级KM小鼠雌、雄各半,体质量18~22 g,SPF级SD大鼠雌、雄各半,体质量180~220 g,均购买于上海杰思捷實验动物有限公司,合格证号SCXK(沪)20130006。

2方法

21实验用药的制备

211禹余粮水煎液制备取禹余粮颗粒,第1次加10倍量水,加热,煮沸1 h后纱布过滤,所得药液即为头煎药液。将过滤下来的药渣加10倍量水继续加热,煮沸1 h后纱布过滤,所得药液为二煎药液。将2次煎药液合,并浓缩至每40 mL药液含5 g生药,即为水煎液低剂量,在此基础上再进行浓缩,使得每20 mL药液含5 g生药,即为水煎液中剂量,在此基础上再进行浓缩,使得每10 mL药液含5 g生药,即为水煎液高剂量。

212禹余粮粉取禹余粮药材,置玛瑙研钵中研细,过100目筛,用05% CMCNa调匀,按水煎液的低、中、高剂量分别配制。

213禹余粮渣将水煎煮后的药渣按禹余粮粉制备方法制备。

214华法林钠溶液取称华法林纳5 mg,用05% CMCNa溶解,定容至100 mL。

215维生素K生理盐水溶液取7 mg维生素注射液,用05% CMCNa溶解定容至30 mL,待用。

22动物分组及给药

221小鼠华法林钠出血模型昆明种小鼠90只,雌雄各半,根据体重随机分为9组,每组10只,分别为华法林模型组、华法林模型沉积型水煎液用药组、华法林模型沉积型粉末用药组、华法林模型沉积型药渣用药组、华法林模型淋滤浸染型水煎液用药组、华法林模型淋滤浸染型粉末用药组、华法林模型淋滤浸染型药渣用药组、华法林阳性药组、空白组,用药组统一用高剂量给药。

222大鼠相关血液指标的测定SD清洁级大鼠190只,雌雄各半,根据体重随机分为19组,每组10只,分为禹余粮2种矿物成因的样品水煎液、粉末、药渣分别按人临床剂量的5,10,20倍分别配制总共分成18组加1组空白对照。每天给药1次,连续灌胃15 d,空白组给05% CMCNa生理盐水。

23小鼠华法林钠出血模型的制备

参照文献复制华法林钠出血模型[13],华法林模型用药组,禹余粮、华法林分别灌胃7 d,空白对照组给等量05% CMCNa溶液,华法林模型组、华法林模型阳性组口服灌胃给药华法林。第7天,华法林模型阳性组在口服灌胃给药华法林后,给予尾静脉注射维生素K注射液,空白组给予等量05% CMCNa溶液。末次给药后1 h后分别用断尾法、玻片法测各组出血时间和凝血时间。

24小鼠出血时间和凝血时间测定

用手术刀距小鼠尾尖1 cm处剪断,待血液自行溢出时开始计时,每隔10 s用滤纸吸附血滴1次,直至滤纸吸时无血迹,所经时间作为出血时间。

用毛细管扎破小鼠眼眶血液滴到载玻片上开始计时,用毛细管挑丝,有血丝出现即记为凝血时间。

25大鼠血液指标测定

第15天,各组正常给药1 h后,各组大鼠用10%水合氯醛麻醉,用EDTA抗凝管腹主动脉取血,取1 mL全血分装分别测定血浆复钙时间,血小板黏附率,血小板聚集率,血浆黏度。

26矿物成分分析

261偏光显微镜分析选择可供切割的块状禹余粮样品,先用切片机切割出一平面,用磨片机磨成光面,用偏光显微镜进行单偏光和正交偏光分析,结果见图1,2。

262X射线衍射分析将岩样破碎后玛瑙研钵研磨至200目。测试条件为铜(Cu)靶,电压 40 kV,电流40 mA,步宽002°,扫描范围3~60°(2θ)。黏土自然风干样品测试步宽 001°,扫描范围3~36°(2θ)。利用Jade 60软件识别并计算各矿物衍射峰高度和面积。矿物组成的鉴定以及相对含量计算按照Cook等的方法进行[14]。

27统计学方法

采用SPSS 190统计软件对数据进行双样本t检验及方差分析,实验数据以±s表示。

3结果

31小鼠华法林钠出血模型出血时间和凝血时间

与空白组比,模型组能延长(P<005)出血时间,与模型组相比,阳性维生素K、淋滤浸染型水煎液和沉积型水煎液能显著(P<001)缩短出血时间,阳性维生素K能显著(P<001)缩短凝血时间,淋滤浸染型水煎液、沉积型水煎液和沉积型粉末可(P<005)缩短凝血时间,结果见表1。

32大鼠血液指标

与空白组比较,淋滤浸染型水煎液低剂量、中剂量和粉末中剂量,以及沉积型水煎液高剂量和药渣

与空白组比较,禹余粮淋滤浸染型水煎液高剂量组能显著降低(P<005)血小板黏附率,沉积型水煎液高能显著增加(P<005)血小板黏附率,淋滤浸染型水煎液高剂量、药渣高剂量和淋滤浸染型粉末低剂量、药渣低剂量能降低(P<005)血小板聚集率,沉积型水煎液高剂量、粉末高剂量能增加(P<005)血小板聚集率,结果见表3。

33矿物成分分析

331偏光显微镜分析通过单偏光及正交偏光显微分析,淋滤浸染型可见石英、极少量绢云母和褐铁矿等矿物组成;沉积型可见石英、褐铁矿和少量钠长石等矿物组成,见图1。

332X射线衍射分析淋滤浸染型主要矿物成分为高岭石、石英、针铁矿、白云母,沉积型主要矿物成分为石英、伊利石、钠长石、针铁矿、高岭石。其中禹余粮主要成分碱式氧化铁[FeO(OH)]针铁矿含量沉积型比淋滤浸染型高出许多。矿物组成及组成见图2,表4。

A 淋滤浸染型,单偏光;B 淋滤浸染型,正交偏光;C 沉积型,单偏光;D 沉积型,正交偏光。

4讨论

血浆黏度增大会增加机体形成血栓的趋势,本实验2种不同成因禹余粮均能不同程度的降低血浆黏度,说明不会造成淤血倾向。血浆复钙时间未有显著性差异,均在临床正常值以内,课题组前期对凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)凝血4项测定的结果表明,两者也没有显著性差异,说明禹余粮的止血机制不是作用与内原性、外源性凝血系统。

血小板黏附率和血小板聚集率的结果基本一致,均是沉积型水煎液高剂量组增加,淋滤浸染型水煎液降低,说明沉积型成因的止血效果较好,可能是禹余粮作用于血小板相关功能。沉积型禹余粮的针铁矿含量比淋滤浸染型含量高近4倍,尚有伊利石和钠长石组成,其中伊利石与蛋白质可以形成复合物[15],在体内中性、碱性环境下,蛋白石释放出来,用来治疗疾病,可能是增加止血效果的原因之一。

出血时间和凝血时间是检测止血药效最直观的指标,研究表明,与血液指标的测定结果基本相符,2种不同矿物成因禹余粮样品均以水煎液的效果最好。综合分析,禹余粮的止血作用以沉积型为佳,尚需通过血清药物化学等研究方法阐明禹余粮临床发挥止血作用的效应物质基础,包括所含金属离子的种类、价态等对止血作用的干预作用,并深入探讨其作用机制。

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[责任编辑孔晶晶]

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