SKP2突变载体S72A和S72D的构建以及生物学功能研究

曲 璇,李 军,马晓军,韩洛川,史海龙

(陕西中医药大学基础医学院生物学教研室,咸阳 712046;*通讯作者,E-mail:quxuan519@163.com)

SKP2突变载体S72A和S72D的构建以及生物学功能研究

曲 璇*,李 军,马晓军,韩洛川,史海龙

(陕西中医药大学基础医学院生物学教研室,咸阳 712046;*通讯作者,E-mail:quxuan519@163.com)

目的 构建SKP2突变载体SKP2S72A和SKP2S72D并验证其生物学功能。 方法 利用一步法PCR合成含有SKP2S72A和SKP2S72D突变序列,通过酶切连接将序列插入pBabe载体中,将克隆载体转入大肠杆菌后,筛选阳性克隆进行序列测定,将鉴定正确的克隆转染HEK293细胞,并利用Western blot实验鉴定基因表达及其对靶蛋白P27的影响。 结果 PCR扩增得到序列测定结果与预期序列完全一致;构建的SKP2S72A和SKP2S72D突变质粒,用于基因转染纯度较好,在真核细胞中成功表达,并且影响了P27的蛋白水平。 结论 构建获得SKP2突变载体,为今后SKP2泛素连接酶活性的功能研究提供良好的基础。

S期激酶相关蛋白; 突变载体; 过表达载体

SKP2(S-phase kinase-associated protein 2)称为S期激酶相关蛋白2,是F-box家族成员之一。研究表明,在蛋白泛素化降解过程中,SKP2发挥E3泛素连接酶的作用,通过募集泛素分子来标记靶蛋白,并实现对蛋白的降解过程,如细胞周期调控蛋白P27、P21等[1,2]。SKP2在多种肿瘤细胞中呈高表达,通过调控细胞周期、细胞增殖和迁移等过程,促进肿瘤的发生发展,如结肠癌[3]、乳腺癌[4]、黑素瘤[5]等。在细胞内,SKP2能够被PI3K/AKT信号通路的激活,其一级结构中的丝氨酸72位点能够被AKT识别并磷酸化,因此,PI3K/AKT信号通路在SKP2的活化中扮演重要角色[6,7]。为了深入研究SKP2活化对细胞生物学行为的影响,我们构建了SKP2点突变体:失活型突变体SKP2S72A和组成性活化突变体SKP2S72D,并对其表达和功能进行了验证。……