CD133基因启动子的克隆与序列分析

王晓峰，张天夫，刘 新，刘晓军

(1.吉林大学中日联谊医院 口腔科,吉林 长春130033；2.吉林大学中日联谊医院 妇产科)

CD133基因启动子的克隆与序列分析

王晓峰1，张天夫1，刘 新1，刘晓军2*

(1.吉林大学中日联谊医院 口腔科,吉林 长春130033；2.吉林大学中日联谊医院 妇产科)

近些年来，口腔颌面部恶性肿瘤的发病率逐年增加[1]。虽然目前针对恶性肿瘤的治疗手段有了很多新的进展,但仍有部分肿瘤患者不能治愈。自从肿瘤干细胞(CSCs)理论提出后，给肿瘤患者带来了新的曙光[2]。有研究表明，CD133是某些头颈部肿瘤干细胞的表面特异性标记[3，4]，我们推测CD133+细胞可能是头颈部肿瘤的干细胞。所以我们克隆了CD133基因的启动子并对其进行序列分析，为进一步探究CD133基因与肿瘤干细胞之间的关系提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DH5α菌株和质粒，来源于吉林大学中日联谊医院科研中心。DNA Marker及限制性内切酶SpeI、MluI(日本Takara 公司)。限制性内切酶PacⅠ，SalⅠ(英国NEB公司)。Trans2K Plus DNA Marker(上海宝曼生物技术公司)。Blood gDNA Miniprep Kit(美国Biomiga公司)。引物合成(上海生工技术有限公司)。

1.2 人CD133基因启动子的克隆

1.2.1 DNA提取及PCR引物设计 按试剂盒说明书进行外周血细胞基因组DNA的提取，并电泳鉴定。从Genbank数据库获得人CD133基因启动子的DNA序列，PCR产物的长度为1 810 bp。设计引物如下：

上游引物： 5’-GTAGTCGACCTTCAGTGCCTCTTTCAGT-3’；下游引物5’-GCCTTAATTAAGTGGGGATCTGCCTCAGTC-3’。

1.2.2 PCR反应 以人外周血基因组DNA为模板进行PCR反应，反应产物经电泳鉴定。进行PCR产物的回收，产物电泳鉴定后于-20℃保存。

1.2.3 DH5α感受态细菌的制备及CD133基因启动子PCR产物TA克隆 制备DH5α感受态细菌， -80℃保存。进行CD133基因启动子PCR产物的T-A连接，16℃，30 min。……