GYY4137对小鼠原代肝细胞胞质内脂质分解的影响*

王红钢， 张优敬， 皇甫超申， 王 军， 吴东栋， 钟培育， 王国英， 李彦章

(河南大学基础医学院， 河南 开封 475004)

·短篇论著·

GYY4137对小鼠原代肝细胞胞质内脂质分解的影响*

王红钢， 张优敬， 皇甫超申， 王 军， 吴东栋， 钟培育， 王国英， 李彦章△

(河南大学基础医学院， 河南 开封 475004)

目的： 探讨新合成的硫化氢(H2S)供体GYY4137对小鼠原代肝脂肪变性细胞胞质内脂质分解的影响。方法: 体外用油酸诱导肝细胞脂肪变性模型。采用两步原位灌流法分离C57BL/6小鼠原代肝细胞并分为4组：对照组用正常培养液培养54 h；模型组用含1.2 mmol/L油酸(溶于10% BSA)的培养液培养48 h，再用RPMI-1640培养液培养6 h； H2S组和DL-炔丙基甘氨酸(PAG；胱硫醚γ-裂解酶抑制剂，抑制H2S合成)组则用含有1.2 mmol/L油酸的培养液培养48 h，再用无血清无酚红的RPMI-1640培养液(分别给予含有1 mmol/L GYY4137和200 μmol/L PAG)培养6 h。测量细胞甘油释放量及胞内激素敏感性脂肪酶(HSL)的蛋白表达量。结果: 和模型组相比， H2S组培养液中甘油释放量和磷酸化HSL(p-HSL)蛋白表达水平明显降低，而PAG组又明显升高。结论: 在小鼠原代脂肪变性肝细胞中，GYY4137可能通过抑制HSL的磷酸化水平而减少胞质内脂质分解。

硫化氢； 胞质内脂质分解； 肝细胞； 油酸

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种普遍的肝病，它主要由脂肪在肝细胞中过度聚集导致[1]。在肝细胞中，有2条甘油三酯分解途径，一条是脂质自嗜分解途径，另一条是胞质内脂质分解途径。肝细胞胞质内脂质分解减弱是其脂肪变性的重要原因[2]。

硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是哺乳动物体内一种重要的气体信号分子，在脂代谢和心肌细胞损伤等生理病理过程起重要作用，它在哺乳动物体内以半胱氨酸为底物，在胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)、胱硫醚β-合酶(cystathionine β-synthase，CBS)及3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)的催化下产生[3-4]。激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)是脂肪分解过程中的关键酶，它被蛋白激酶磷酸化后具有活性，催化脂肪分解[5]。GYY4137是一个新合成的H2S供体，能在生理温度和pH下的溶液中缓慢持续地释放H2S，可较好地模拟体内H2S 释放过程[6]。在正常生理条件下，外源性或内源性H2S能影响脂质代谢，其机制还未完全清楚[7]。研究显示，抑制小鼠脂肪细胞中CSE/H2S系统可增强胞质内脂质分解作用，减轻脂肪堆积，而外源性H2S则会降低脂肪分解作用[8]，由此本课题组推测外源性H2S可能对脂肪变性肝细胞胞质内脂质分解具有调节作用。本文用GYY4137作为H2S的供体，用油酸(oleic acid，OA)诱导建立肝脂肪变性模型，在体外研究外源性H2S对小鼠原代肝细胞胞质内脂质分解的影响，为NAFLD的临床药物治疗及H2S相关药物研究提供一定的理论依据。

材 料 和 方 法

1 实验动物

实验采用4～6周龄雄性C57BL/6小鼠(南京大学动物模型中心)，18～22 g，毛发光亮无脱毛，四肢无缺陷，全身无畸形及肿块，摄食、活动度和精神状态良好。

2 方法

2.1 细胞及其分组 按照Seglen的两步灌流法[9]分离小鼠原代肝细胞。实验分为对照(control)组(RPMI-1640培养液+10%BSA)、模型(model)组(RPMI-1640培养液+10%BSA+1.2 mmol/L OA)、H2S组和DL-炔丙基甘氨酸(DL-proparylglycine，PAG；CSE抑制剂，抑制H2S合成)组(用RPMI-1640培养液+10%BSA+1.2 mmol/L OA孵育原代肝细胞48 h后，分别给予1 mmol/L GYY4137和200 μmol/L PAG处理6 h)。

2.2 油红染色 PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定10 min，37 ℃避光油红染色20 min， 再用50%异丙醇清洗20 s，双蒸水洗3遍, 然后在倒置荧光显微镜下拍照。

2.3 MTT法检测不同浓度油酸对小鼠原代肝细胞细胞活力的影响 肝细胞以1×107/L、每孔0.2 mL接种于96孔细胞培养板中，培养24 h后在培养液内分别加入不同浓度油酸(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mmol/L)继续培养48 h后，各孔分别加入MTT试剂(5 g/L) 20 μL，培养4 h后弃培养液，各孔分别加入150 μL DMSO并震荡5 min，在酶标仪上测定570 nm处的吸光度(A)值，细胞活力=A处理组/A对照组×100%。上述实验重复3次。

2.4 Western blot PBS清洗细胞3遍，每孔加入200 μL RIPA裂解液，混匀后室温静置10 min，然后将细胞转移至1.5 mL的离心管中，在冰上震荡裂解5 min，12 000×g、4 ℃离心，取上清按照BCA试剂盒检测蛋白浓度。上样50 μL，100 V电泳45～60 min，转膜后取出PVDF膜，用TBST清洗10～15 min。 I 抗用含脱脂奶粉的TBST稀释(1∶1 000)，室温孵育2 h， TBST缓冲液洗PVDF膜10 min，洗3次，加入 II 抗(1∶1000稀释，HRP标记)室温孵育2 h， TBST缓冲液洗PVDF膜10 min×3次，加入显色液照相保存结果。

2.5 检测细胞甘油释放量 收集各组细胞培养液，4 ℃、12 000×g离心10 min，吸取上清按照试剂盒的说明书(原理：在ATP存在下甘油被甘油激酶磷酸化为3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化产生过氧化氢；过氧化氢在过氧化物酶作用下转化为苯醌亚胺，苯醌亚胺光密度值与甘油浓度成正比)，用比色法测量培养基中的甘油含量。

3 统计学处理

统计分析采用GraphPad Prism 5统计软件。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用单因素方差分析比较组间均数的差异， 以P<0.05 表示差异有统计学意义。

结 果

1 倒置显微镜下的小鼠原代肝细胞的形态

分离的小鼠原代肝细胞的纯度和存活率均在95%以上，在倒置显微镜下，细胞贴壁，并具有典型的肝细胞形态: 细胞呈不规则圆形或多边形，边界轮廓清晰，胞体很大，核呈圆形或椭圆形，有单核或双核，见图1。

Figure 1.The morphology of mouse primary hepatocytes under inverted microscope (×200).

图1 倒置显微镜下小鼠原代肝细胞的形态

2 MTT实验确定诱导液中油酸的适宜浓度

为确定诱导液中合适的油酸浓度，本实验用MTT法测量不同浓度油酸诱导后肝细胞的活力，结果表明诱导液中油酸浓度在0.8～1.2 mmol/L时，肝细胞活力较高，当诱导液中油酸的浓度大于1.2 mmol/L或小于0.8 mmol/L时，细胞活力明显下降。

本实验用1.2 mmol/L OA诱导肝细胞48 h后进行油红染色，结果显示细胞生长状态良好，且肝细胞胞质内有大量脂滴积聚，提示肝细胞脂肪变性模型构建成功，见图2、3。

Figure 2.The effect of different concentrations of OA on the viability of mouse primary hepatocytes detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L;#P<0.05vs1.2 mmol/L.

图2 不同浓度油酸对肝细胞活性的影响

Figure 3.The lipid accumulation in the hepatocytes induced by OA (oil red O staining, ×400). OA at 1.2 mmol/L was used to induce hepatocytes for 48 h to establish the steatosis model. The fat drops were indicated by the arrows. A: control group; B: model group.

图3 油酸诱导肝细胞脂质蓄积

3 H2S对肝细胞胞质内的脂质分解的影响

肝细胞释放至培养液的甘油量可反映胞质内脂质分解的状况[10]。收集细胞培养液并检测其中细胞释放的甘油量，结果显示对照组培养液中含甘油较少；模型组细胞培养液中甘油量比对照组显著增多(P<0.05)；H2S组培养液中甘油量又比模型组显著减少(P<0.05)；和H2S组相比，PAG组细胞培养液中甘油量显著增多(P<0.05)，提示胞质内脂质分解可被外源性H2S抑制，见图4。

Figure 4.The effect of H2S on the glycerin release from the he-patocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsH2S group.

图4 H2S对肝细胞甘油释放量的影响

4 H2S对肝细胞胞质内激素敏感性脂肪酶蛋白表达量的影响

检测结果显示，各组细胞中总的激素敏感性脂肪酶(total HSL，t-HSL)的表达均无显著差异；模型组细胞中磷酸化的激素敏感性脂肪酶(phosphorylated HSL，p-HSL)与对照组相比显著增多(P<0.05)； H2S组细胞中p-HSL表达水平比模型组显著降低(P<0.05)，提示外源性H2S可抑制HSL的磷酸化，见图5。

Figure 5.The effect of H2S on the phosphorylation of HSL in the hepatocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

图5 H2S对肝细胞内激素敏感性脂肪酶磷酸化的影响

讨 论

肝脏在脂质代谢中有重要作用，其功能异常可导致NAFLD。肝细胞在生理条件下可分解脂肪，但不储存脂肪；过多的脂肪在肝细胞内聚集成脂滴，代偿性地增加胞质内脂质分解[11]，本实验选用肝细胞甘油释放量作为衡量肝细胞胞质内脂质分解代谢的指标。

体外油酸孵育细胞是制作细胞脂肪变性模型的常用方法[12]。本文选用1.2 mmol/L油酸既成功诱导建立脂肪变性模型，同时又最大程度地消除油酸细胞毒性对实验结果的影响。HSL是胞质内催化脂肪分解的关键酶，该酶的磷酸化形式具有活性，可催化胞质内甘油三酯分解，因此HSL磷酸化水平可反映胞质内脂肪分解的强弱。作为一种新型H2S缓释剂，GYY4137在高剂量时有细胞毒性，而少剂量时又不能显著改变胞内H2S水平[13]。研究表明，GYY4137可抑制大鼠脂肪细胞中HSL的活性，抑制脂肪细胞胞质内脂质分解[14]，但对肝细胞中HSL的影响还不清楚。本文用油酸诱导小鼠原代肝细胞建立脂肪变性模型，发现来源于GYY4137的H2S可抑制胞质内脂质分解，同时胞质内p-HSL水平降低，因此本文推测，GYY4137可能通过抑制HSL的磷酸化而减弱胞质内的脂质分解。若该推测成立，将为NAFLD临床治疗开创一个新的思路，也为开发H2S药物提供坚实的基础。本文又发现模型组胞质内的脂质分解及p-HSL水平均比对照组增强，提示油酸诱导可导致胞质内脂质分解的代偿性增强。Geng等[8]研究表明，在小鼠脂肪细胞中，GYY4137可减少cAMP水平而抑制蛋白激酶A的激活，进而降低HSL磷酸化水平抑制胞质内脂质分解。本文中GYY4137究竟通过何种途径抑制HSL的磷酸化有待进一步研究。有研究表明NaHS可通过促进脂代谢而改善小鼠肝脂肪变[7]，与本实验结果矛盾，也可能本文结论只是GYY4137本身的副作用或者其它，其确切原因有待进一步研究。

综上所述，在小鼠原代脂肪变性肝细胞中，外源性给予H2S供体GYY4137可能通过降低HSL的磷酸化水平而抑制由油酸诱导的胞质内脂质分解的代偿性增强。

[1] 周 鑫， 韩德五， 李素红， 等. 非酒精性脂肪性肝病在代谢综合征相关的2型糖尿病发病中的作用[J]. 中国病理生理杂志， 2011, 27(7):1352-1359.

[2] Fu XM, Xie J, Hu ZW, et al. Mycelium ofHirsutellahepialiChen et Shen activates autophagy and protects against metabolic syndrome in mice fed with high fat diet [J]. Acta Pharm Sin, 2014, 49(5):615-621.

[3] Kimura H. The physiological role of hydrogen sulfide and beyond[J]. Nitric Oxide, 2014, 41:4-10.

[4] 梁伟杰，何洁仪， 张稳柱，等. 硫化氢通过抑制坏死性凋亡对抗高糖引起的H9c2 心肌细胞损伤[J]. 中国病理生理杂志, 2016, 32(3):385-391.

[5] Elshorbagy AK, Church C, Valdivia-Garcia M, et al. Dietary cystine level affects metabolic rate and glycaemic control in adult mice[J]. J Nutr Biochem, 2012, 23(4):332-340.

[6] Lin S, Visram F, Liu W, et al. GYY4137, a slow-releasing hydrogen sulfide donor, ameliorates renal damage associated with chronic obstructive uropathy[J]. J Urol, 2016, 196(6):1778-1787.

[7] Wu D, Zheng N, Qi K, et al. Exogenous hydrogen sulfide mitigates the fatty liver in obese mice through improving lipid metabolism and antioxidant potential[J]. Med Gas Res, 2015, 5(1):1.

[8] Geng B, Cai B, Liao F, et al. Increase or decrease hydrogen sulfide exert opposite lipolysis, but reduce global insulin resistance in high fatty diet induced obese mice [J]. PLoS One. 2013, 8(9):e73892.

[9] Martins SV, Madeira A, Lopes PA, et al. Adipocyte membrane glycerol permeability is involved in the anti-adipogenic effect of conjugated linoleic acid[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 458(2):356-361.

[10]Watanabe A, Kato T, Ito Y, et al. Aculeatin, a coumarin derived fromToddaliaasiatica(L.) Lam., enhances differentiation and lipolysis of 3T3-L1 adipocytes[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 453(4):787-792.

[11]Rose P, Dymock BW, Moore PK. GYY4137, a novel water-soluble, H2S-releasing molecule[J]. Methods Enzymol, 2015, 554:143-167.

[12]Lu S, Gao Y, Huang X, et al. GYY4137, a hydrogen sulfide (H2S) donor, shows potent anti-hepatocellular carcinoma activity through blocking the STAT3 pathway[J]. Int J Oncol, 2014, 44(4):1259-1267.

[13]Xie H, Xu Q, Jia J, et al. Hydrogen sulfide protects against myocardial ischemia and reperfusion injury by activating AMP-activated protein kinase to restore autophagic flux[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 458(3):632-638.

[14]Locher L, Häussler S, Laubenthal L,et al. Effect of increasing body condition on key regulators of fat metabolism in subcutaneous adipose tissue depot and circulation of nonlactating dairy cows[J]. J Dairy Sci, 2015, 98(2):1057-1068.

(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Effect of GYY4137 on cytosolic lipid decomposition in mouse primary hepatocytes

WANG Hong-gang, ZHANG You-jing, HUANG-FU Chao-shen, WANG Jun, WU Dong-dong, ZHONG Pei-yu, WANG Guo-ying, LI Yan-zhang

(TheBasicMedicalCollegeofHenanUniversity,Kaifeng475004,China.E-mail: 10190011@henu.edu.cn)

AIM: To evaluate the effect of GYY4137， a novel hydrogen sulfide (H2S) donor， on cytosolic lipid decomposition in mouse primary steatosis hepatocytes. METHODS: Oleic acid (OA) was used to induce hepatic steatosis modelinvitro. The C57BL/6 mouse primary hepatocytes isolated and cultured by 2-stepinsituperfusion were divided into 4 groups: the cells in control group were incubated with normal medium for 54 h; the cells in model group were incubated with OA at 1.2 mmol/L for 48 h followed by serum-free phenol red-free RPMI-1640 for 6 h; the cells in H2S group or DL-propar-gylglycine (PAG； an inhibitor of cystathione γ-lysase， inhibiting H2S synthesis) group were incubated with OA at 1.2 mmol/L for 48 h followed by serum-free phenol red-free RPMI-1640 which contained 1 mmol/L GYY4137 or 200 μmol/L PAG for 6 h. The glycerin release and the protein expression of hormone-sensitive lipase (HSL) in the cells were mea-sured. RESULTS: Compared with model group, the glycerin release and the protein expression of phosphorylated HSL (p-HSL) in H2S group decreased significantly， while those increased significantly in PAG group. CONCLUSION: In steatosis hepatocytes, exogenous H2S possibly decreases cytosolic lipid decomposition by decreasing the protein level of p-HSL.

Hydrogen sulfide； Cytosolic lipid decomposition； Hepatocytes； Oleic acid

1000- 4718(2017)08- 1520- 04

2017- 06- 05

2017- 06- 27

国家自然科学基金资助项目(No. 3130084)；河南省高校重点科研项目(No. 16A310001)

R575.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.028

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△通讯作者 Tel: 13663781967； E-mail: 10190011@henu.edu.cn