柿叶黄酮治疗实验性口腔溃疡的作用及其抗炎机制研究

张永丽　王朔　郝麦玲

【摘要】 目的 探讨柿叶黄酮对大鼠口腔溃疡的治疗作用及其抗炎机制。方法 60只SD大鼠， 分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组及柿叶黄酮20、40、80 mg/kg组， 每组10只。空白对照组不做处理， 其他各组建立口腔溃疡大鼠模型（醋酸法）， 空白对照组、模型对照组给予灌胃等体积生理盐水， 阳性对照组给予灌胃西瓜霜， 柿叶黄酮组给予灌胃相应剂量柿叶黄酮。比较造模后第4、7天的溃瘍面积， 测定溃疡组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。结果 用药后4、7 d， 阳性对照组、柿叶黄酮40 mg/kg

组、柿叶黄酮80 mg/kg组大鼠的溃疡面积均小于模型对照组， 差异具有统计学意义 （P<0.05）。模型对照组（66.5±4.1）ng/L、阳性对照组（38.7±4.7）ng/L、柿叶黄酮组[（40.2±3.8）、（35.8±4.6）、（32.6±3.8）ng/L]大鼠溃疡组织内TNF-α水平高于空白对照组（27.8±3.2）ng/L， 差异具有统计学意义 （P<0.05）。阳性对照组、柿叶黄酮组大鼠溃疡组织内TNF-α水平低于模型对照组， 差异具有统计学意义 （P<0.05）。结论 柿叶黄酮对醋酸诱导的口腔溃疡有一定的治疗作用， 其机制可能与降低炎症反应有关。

【关键词】 柿叶黄酮；口腔溃疡；氧化应激；炎症

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.20.103

【Abstract】 Objective To investigate the therapeutic effect of persimmon leaf flavonoid on oral ulcer in rats and its anti - inflammatory mechanism. Methods A total of 60 SD rats were divided into blank control group， model control group and positive control group， persimmon leaf flavonoid 20， 40 and 80 mg/kg group， with 10 rats in each group. The blank control group received no treatment， and the other groups established the models of rat oral ulcer （acetic acid）. Blank control group， model control group was treated with intragastric administration of equal volume normal saline， the positive control group was treated with intragastric administration of watermelon frost， and persimmon leaf flavonoid group was treated with intragastric administration of corresponding dose persimmon leaf flavonoid. The ulcer area was compared after 4 and 7 days of modeling， and the level of tumor necrosis factor-α （TNF-α） in ulcer tissue was measured. Results After 4 and 7 d of medication， the positive control group， persimmon leaf flavonoid 40 and 80 mg/kg group had smaller ulcer area than model control group， and the difference had statistical significance （P<0.05）. The model group （66.5±4.1） ng/L， positive control group （38.7±4.7） ng/L and persimmon leaf flavonoid group [（40.2±3.8）， （35.8±4.6） and （32.6±3.8） ng/L] had higher TNF-α level in ulcer tissue than bland control group （27.8±3.2）ng/L， and their difference had statistical significance （P<0.05）. The positive control group and persimmon leaf flavonoid group had lower TNF-α level in ulcer tissue than model control group， and the difference had statistical significance （P<0.05）. Conclusion Persimmon leaf flavonoid have a certain therapeutic effect on acetic acid-induced oral ulcers， and its mechanism may be related to the reduction of inflammatory response.

【Key words】 Persimmon leaf flavonoid； Oral ulcer； Oxidative stress； Inflammationendprint

口腔溃疡（oral ulcer）是口腔黏膜病中最常见的疾病， 以复发性口腔溃疡（recurrent oral ulcer， ROU）为主， 一般人群中的发病率可达20%[1]。复发性口腔溃疡的临床特征有：致痛性、自限性和反复发作等。患者常由于疼痛而导致咀嚼、饮水、吞咽以及说话困难， 严重降低患者的生活质量[2]。复发性口腔溃疡的病因目前尚不明确， 由于复发性口腔溃疡病因和病机的复杂性， 导致臨床上缺乏特效治疗药物[3]。在复发性口腔溃疡的病因和病机中， 炎症反应对疾病的发生发展发挥着重要作用[4]。柿叶黄酮（persimmon leaf flavonoid， PLF）是柿叶中的主要有效成分。据明代《滇南本草》记载“经霜叶敷臁疮”， 臁疮即为小腿的一种慢性溃疡， 由此提示外用柿叶可用于治疗溃疡。现代药理学研究发现， 柿叶黄酮具有抗氧化、抗炎等多种药理作用[5]。基于上述理论基础， 作者通过建立口腔溃疡模型， 进行柿叶黄酮的药物干预， 观察柿叶黄酮的疗效并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1. 1 实验动物 SPF级健康SD大鼠60只， 体重200～240 g， 雌雄各半， 购于北京维通利华实验动物技术有限公司， 合格证号为SCXK（京）2012-0001。饲养1周， 以适应新环境。12 h昼夜交替， 室温20～25℃， 湿度为40%～60%， 普通饲料喂养， 自由饮水。

1. 2 试剂和药品 柿叶黄酮由陕西慈缘生物技术有限公司提供；桂林西瓜霜（桂林三金药业股份有限公司 ， 国药准字Z45021599）；TNF-α Elisa试剂盒（上海朗顿生物技术有限公司， 20161122TG）。

1. 3 主要仪器 小动物麻醉机（瑞沃德生命科技有限公司）；Infinite? 200 PRO酶标仪（瑞士TECAN公司）；低温高速离心机（德国eppendorf公司）；游标卡尺（上海首丰精密仪器有限公司）。

1. 4 方法

1. 4. 1 大鼠口腔溃疡模型的制备 参考文献[6]方法：以戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠， 将50%冰醋酸滤纸片（3 mm×3 mm）置于下切牙唇侧穹窿区30 s， 移除滤纸片后观察受损区变化。空白对照组不做处理。模型大鼠在冰醋酸处理后24 h均出现明显溃疡面， 肉眼观察溃疡面的黏膜呈凹陷性损伤， 表面为苍白色， 周围充血水肿明显， 口腔溃疡模型制备成功。

1. 4. 2 实验分组和给药 SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组及柿叶黄酮20、40、80 mg/kg组， 每组10只。阳性对照组给予灌胃西瓜霜200 mg/kg， 柿叶黄酮各组给予相应剂量的柿叶黄酮， 空白对照组、模型对照组给予灌胃等体积的生理盐水。于造模后第2天给药， 连续给药7 d。

1. 5 观察指标

1. 5. 1 溃疡面积的测定[7] 用游标卡尺测量各组模型大鼠给药前及给药后第4、7天口腔溃疡的最大横径（d1）及最大纵径（d2）， 计算溃疡面积（溃疡面积=π×d1×d2×1/4， π取值3.14）。

1. 5. 2 样品处理 末次给药1 h后， 戊巴比妥钠麻醉， 先腹主动脉取血， 后取溃疡面组织。每组留取7只大鼠的正常或溃疡组织加入9倍量的冷生理盐水进行匀浆处理， 4℃、3000 r/min离心10 min， 分离上清液， -20℃保存。

1. 5. 3 TNF-α的测定 按试剂盒说明书操作， 测定组织中TNF-α的水平。

1. 6 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用单因素方差分析（One way AVONA）。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 柿叶黄酮对大鼠口腔溃疡面积的影响 用药前， 模型对照组、阳性对照组、柿叶黄酮组大鼠的溃疡面积比较， 差异无统计学意义（P>0.05）。用药后4、7 d， 阳性对照组、柿叶黄酮40 mg/kg组、柿叶黄酮80 mg/kg组大鼠的溃疡面积均小于模型对照组， 差异具有统计学意义 （P<0.05）。见表1。

2. 2 柿叶黄酮对口腔溃疡大鼠溃疡组织中TNF-α的影响

模型对照组（66.5±4.1）ng/L、阳性对照组（38.7±4.7）ng/L、柿叶黄酮组[（40.2±3.8）、（35.8±4.6）、（32.6±3.8）ng/L]大鼠溃疡组织内TNF-α水平高于空白对照组（27.8±3.2）ng/L， 差异具有统计学意义 （P<0.05） 。阳性对照组、柿叶黄酮组大鼠溃疡组织内TNF-α水平低于模型对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

复发性口腔溃疡是人群中最为常见的口腔黏膜疾病， 疼痛和反复发作给患者带来诸多不便。复发性口腔溃疡的发病原因目前尚不清楚， 已知与众多因素如内分泌紊乱、免疫功能失调、创伤、吸烟、应激、非甾体类抗炎药物的应用、维生素或微量元素的缺乏、遗传因素等有关[1]。

现代研究发现， 复发性口腔溃疡属于一种慢性炎症性疾病[8]。TNF-α是一种关键的炎性细胞因子， 可通过影响内皮细胞的粘附功能和诱导中性粒细胞趋化等作用启动炎症反应。目前已经开发出抗TNF-α的药物， 可以改善难治性复发性口腔溃疡的症状[9， 10]。本次研究发现， 柿叶黄酮20、40、80 mg/kg可显著的降低溃疡组织内的TNF-α水平。

近年来针对复发性口腔溃疡病因的复杂性， 基于天然植物药效成分的多靶点和多向性， 人们开始从天然产物中寻求治疗复发性口腔溃疡的新药[11]。已知柿叶黄酮是一种良好的天然抗氧化剂， 除了抗氧化作用外还有抗炎、止血、抗菌等作用[5]。柿叶黄酮的这些药理学作用可针对复发性口腔溃疡复杂的病因发挥多向性的治疗效果。本研究初步证实柿叶黄酮可用于口腔溃疡的治疗， 其机制可能与抗炎作用有关。对于柿叶黄酮防治口腔溃疡的其他机制还有待于进一步的研究。endprint

参考文献

[1] Natah SS， Konttinen YT， Enattah NS， et al. Recurrent aphthous ulcers today： a review of the growing knowledge. International Journal of Oral & Maxillofacial Surgery， 2004， 33（3）：221.

[2] Yang Y， Zhang T， Dong Z， et al. Short-Term Efficacy of Pudilan Keyanning Toothpaste in Treatment of Minor Recurrent Aphthous Ulcers. Evid Based Complement Alternat Med， 2016：9125327.

[3] Williams LA， Bramwell BL. Current concepts in the treatment of recurrent aphthous ulcers. Int J Pharm Compd， 2011， 15（1）：13-18.

[4] Avci E， Akarslan ZZ， Erten H， et al. Oxidative stress and cellular immunity in patients with recurrent aphthous ulcers. Braz J Med Biol Res， 2014， 47（5）：355-360.

[5] Xie C， Xie Z， Xu X， et al. Persimmon （Diospyros kaki L.） leaves： a review on traditional uses， phytochemistry and pharmacological properties. Journal of Ethnopharmacology， 2015（163）：229-240.

[6] Hitomi S， Ono K， Yamaguchi K， et al. The traditional Japanese medicine hangeshashinto alleviates oral ulcer-induced pain in a rat model. Archives of Oral Biology， 2016（66）：30-37.

[7] 陳卓，王金磊，庄朋伟，等.清咽滴丸治疗大鼠口腔溃疡的实验研究. 中草药， 2016， 47（1）：106-108.

[8] Alsamadi A， Drozd A， Salem A， et al. Epithelial Cell Apoptosis in Recurrent Aphthous Ulcers. Journal of Dental Research， 2015， 94（7）：928.

[9] ?lebioda Z， Szponar E， Kowalska A. Etiopathogenesis of Recurrent Aphthous Stomatitis and the Role of Immunologic Aspects： Literature Review. Archivum Immunologiae Et Therapiae Experimentalis， 2014， 62（3）：205-215.

[10] ONeill ID. Efficacy of tumour necrosis factor-α antagonists in aphthous ulceration： review of published individual patient data. Journal of the European Academy of Dermatology & Venereology， 2012， 26（2）：231-235.

[11] Ryu HJ， Seo MR， Choi HJ， et al. Infliximab for refractory oral ulcers. American Journal of Otolaryngology， 2014， 35（5）：664-668.

[收稿日期：2017-04-20]endprint