亚洲玉米螟高致病力球孢白僵菌菌株的分离筛选

孙艺昕+门兴元+于毅+张思聪+夏小菊+叶保华+李丽莉

摘要：亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis（Guenée）是我国玉米生产上的重要害虫，目前以化学防治为主。为寻求一种可持续的防治方法，本文从14株白僵菌菌株中初步筛选出对亚洲玉米螟致病力较强的6株白僵菌YB15、YB8、TB1126、TB1358、YB32、TB7，其致死中时间分别为0.66、1.44、1.29、0.99、1.42、1.28 d。同时测定了这6株白僵菌对亚洲玉米螟的致病力，从中筛选出产孢量大、萌发率高及毒力较强的球孢白僵菌YB15，在26℃条件下，该菌株浓度为1×109 孢子·mL-1时，亚洲玉米螟老熟幼虫死亡率达到96.67%，感染僵死率达到73.33%。在亚洲玉米螟的生物防治中有很好的应用潜力。

关键词：亚洲玉米螟；白僵菌；菌株筛选；致病力

中图分类号：S435.132 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）08-0111-04

Abstract The Ostrinia furnacalis （Guenée） （Lepidoptera： Crambidae） is an important insect pest of corn in China.Chemical control is the usual treatment method at present. To explore strategies for sustainable control of the pest population， the pathogenicity of 14 isolates of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana to mature larvae of Asian corn borer was tested under laboratory conditions. Six strains （YB15， YB8， TB1126， TB1358， YB32 and TB7） were selected for their high virulence and the shorter half lethal time （LT50） on mature larvae of O. furnacalis as 0.66， 1.44， 1.29， 0.99， 1.42 and 1.28 days respectively. The virulence against the mature larvae of O. furnacalis was compared between the 6 strains， and the results showed that YB15 strain exhibited the highest germination rate and sporulation and the strongest virulence. It could cause the corrected mortality of 96.67% and the cadaver rate of 73.33% after inoculation with 1×109 spores per milliliter at 26℃for 10 days. In conclusion， the strain YB15 has high application value for biological control of O. furnacalis.

Keywords Ostrinia furnacalis （Guenée）； Beauveria bassiana； Strain screening； Pathogenecity

亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis（Guenée）属于鳞翅目Lepidoptera螟蛾科Crambidae，是一种世界性害虫。其生存能力强，危害潜力大，主要危害玉米、高粱、谷子和棉花等，其中玉米受害最为严重，整个生育期均可受害，一般发生年份减产可达10%～20%，严重发生年份减产可达50%以上，甚至绝产[1，2]。近年来，随着全球气候变化，玉米螟的发生危害愈加严重，对我国粮食生产造成巨大的经济损失。

针对玉米螟的防治方法有多种，目前仍以化学防治为主，但由于玉米螟发生后期，玉米植株较大，不方便施药，防治效率很低或无法防治[1]。其他的物理、生物防治方法在当前一家一户种植模式下难以实现，相比之下，利用白僵菌作为植物内生菌进行生物防治是玉米螟防治的一种新途径。白僵菌（Beauveria bassiana）致病力强，寄生范围广，有较高的开发潜力和应用价值，是现阶段研究和应用较多的昆虫生防菌[3]。近年的研究表明，球孢白僵菌具有植物内生性，能够在自然状态或通过人工接种-灌根[4， 5]、包衣[6]、浸种[4，5]、叶面喷雾[7]等方式定殖在植物中，提高植物的抗病虫能力[8]。因此，对玉米螟高效白僵菌菌株的筛选可以为白僵菌作为内生菌应用奠定基础。

目前，许多科研工作者都进行了玉米螟高致病力白僵菌菌株的筛选，徐艳聆等（2010）[9]从5个田间野生菌株中筛选出2株高毒力菌株；徐文静等（2011） [2]、田志来等（2010） [10]也分别从吉林省玉米螟僵虫中分离筛选获得高效菌株，为白僵菌防治玉米螟的规模化应用奠定了基础。但有研究表明，玉米螟分布广，生物学特征地理变异大[11]，因此不同地区应尽量在本地白僵菌菌株中筛选优良菌株用于防治。鉴于此，笔者选用亚洲玉米螟老熟幼虫，测定在山东田间采集纯化获得的14个球孢白僵菌菌株对其致病力，筛选防治亚洲玉米螟高效白僵菌菌株，为亚洲玉米螟防治提供新的生物防治资源，也为白僵菌作为玉米内生菌防治亚洲玉米螟提供菌株资源。

1 材料与方法endprint

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 供试菌株为球孢白僵菌，采自山东各地，共14株（表1），保存于本实验室。所有供试菌株均采用PDA培养基[12]在 25～28℃下培养活化备用。

1.1.2 供试虫源 供试虫源为连续培养多代的稳定的亚洲玉米螟实验室种群，在温度（26±1） ℃、光周期14 L∶10 D、湿度60%～80%的人工气候室内人工饲料饲养[13]。选取健康老熟幼虫作为供试虫源。

1.2 试验方法

1.2.1 产孢量及孢子萌发率的测定 将供试菌株接种到PDA培养基上培养10 d后，在距平皿边缘等距离处随机打取3块直径为8 mm的菌块，加入0.5%吐温-80无菌水20 mL，磁力搅拌均匀后用血球计数板测定菌液含孢量[14]。

配制含0.05%吐温-80、2.0%蔗糖和0.5%蛋白胨的培养液，将PDA培养基上培养的白僵菌孢子刮入上述培养液中，搅拌均匀后，将孢子浓度调至1.0×105 孢子·mL -1。于25℃下120 r·min-1振荡培养24 h。取样镜检测定孢子萌发率[14]。

1.2.2 高致病力菌株的初筛 将供试菌株接种至冻存管中，待其长满PDA表面后，将20头健康亚洲玉米螟老熟幼虫接入冻存管中，用纱布封口，饲喂人工饲料[13]，使用PDA培养基作为对照。每天观察记录幼虫死亡数并更换饲料，直至玉米螟全部死亡或化蛹，计算致死中时间。每处理重复3次。

1.2.3 高致病力菌株的复筛 采用幼虫浸渍法。将从上述试验中筛选出的高致病力菌株接种在PDA培养基平板上，置于26℃人工气候箱恒温培养10 d左右，用0.1%吐温-80无菌水洗脱孢子，使用血球计数板计数配制母液[15]，然后依次稀释至1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105 孢子·mL-1的孢子悬浮液。

取20头大小均匀的玉米螟老熟幼虫浸入上述配好的孢子悬浮液中，5 s后取出，用滤纸吸干多余水分，放入备好人工饲料的养虫盒中饲养。每日更换饲料，连续观察 10 d，逐日统计不同浓度下幼虫死亡数。以镊子接触虫体不动为死亡。死亡的幼虫取出放入消毒后的培养皿中，保湿后观察虫体，以虫尸上长出肉眼可见的菌丝及孢子计为僵虫，统计致死中浓度、死亡率及僵虫率。每处理重复3 次。以 0.1% 吐温-80溶液作为对照。

1.3 数据统计与分析

试验数据采用统计软件SPSS 16.0处理，根据校正死亡率进行概率值转换后，对剂量进行线性回归分析，建立直线回归模型，从而分别估计剂量效应 LT50 、LC50等参数。

2 结果与分析

2.1 球孢白僵菌的产孢量及孢子萌发率

14株白僵菌的产孢量及孢子萌发率见表2，可知，菌株YB15的产孢量最高，为15.24×106孢子·mL-1，孢子萌发率也达到90.00%； YB27和YB8产孢量次之，分别为12.88×106孢子·mL-1 和10.94×106孢子·mL-1；TB1127的产孢量最低，为1.04×106孢子·mL-1。各菌株的孢子萌发率均达到80%以上。

2.2 对亚洲玉米螟高致病力球孢白僵菌菌株的初筛

14株球孢白僵菌对亚洲玉米螟老熟幼虫的致死中时间见表3，可知，各菌株的致死中时间LT50为0.66～ 3.40 d，其中YB15、YB8、TB1358、TB1126、TB7和YB32对玉米螟的致死中时间均在2 d内，对玉米螟的毒性较强。

2.3 对亚洲玉米螟高致病力球孢白僵菌菌株的复筛

球孢白僵菌菌株TB7、TB1126、TB1358、YB8、YB15和YB32对亚洲玉米螟老熟幼虫的致死中浓度见表4，可知，YB15的LC50最低，为2.51×106孢子·mL-1，说明YB15对亚洲玉米螟的致病力最强。

统计各菌株最高浓度（1×109孢子·mL-1）对试虫的校正死亡率及僵虫率结果见表5，可知，YB15在1×109 孢子·mL-1浓度下第10 d亚洲玉米螟的死亡率达到96.67%，僵虫率达到73.33%；YB8在1×109 孢子·mL-1下第10 d亚洲玉米螟的死亡率达到90.00%，僵虫率达到53.33%；其余几个菌株对亚洲玉米螟的死亡率均在80%以下，僵死率均在35%以下。说明，YB15对亚洲玉米螟的致病力最强。

3 讨论与结论

玉米螟是玉米上的重要害虫，目前对其防治仍以化学防治为主，不仅污染环境，同时造成玉米的农药残留，而且在玉米生长后期，化学防治很难实现，玉米螟的危害不仅直接引起玉米减产，还可诱发玉米穗腐病的发生，因此，生产中急需寻找更加适合的防治方法。白僵菌是广谱性昆虫致病真菌，被越来越多地应用于农林害虫的防治，筛选对玉米螟高毒力的白僵菌菌株可以大大提高对玉米螟的防治优势。本研究室内生测结果表明，采自山东的14个供试白僵菌菌株对玉米螟老熟幼虫均具有不同程度的侵染致病能力，但菌株之间差异较大。初步筛选出的6个菌株对亚洲玉米螟的致死中时间均小于2 d，作用效果普遍较快。菌株YB15在1×109 孢子·mL-1浓度条件下、接种后第10 d对玉米螟老熟幼虫的校正死亡率最高，达96.67%，僵虫率达73.33%，具有较好的应用前景。

白僵菌等微生物制剂的应用可以有效降低化学农药的使用量，充分发挥自然因子对田间害虫的控制力度，保护生态环境。除直接用于防治害虫外，还可将白僵菌接种到玉米、高粱等作物中提高作物对螟虫的抗性[5，16]。本研究筛选获得山东省内对亚洲玉米螟致病力较强的白僵菌菌株，后续将针对白僵菌的田间应用及作为玉米内生菌开展相關研究。

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