苦参碱通过PI3K/Akt信号通路诱导肺癌A549细胞凋亡机制研究

张小文 崔传宝 张平平 郗红娟 高尔 李聃 刘玉珍 赵军 朱凯 张开蒂

·论著·

苦参碱通过PI3K/Akt信号通路诱导肺癌A549细胞凋亡机制研究

张小文 崔传宝 张平平 郗红娟 高尔 李聃 刘玉珍 赵军 朱凯 张开蒂

目的探究苦参碱通过PI3K/Akt信号通路诱导肺癌A549细胞凋亡机制。方法对人肺癌A549细胞进行培养，培养后分为对照组、低浓度组、中浓度组以及高浓度组，对照组中加入生理盐水，分别向低浓度组、中浓度组以及高浓度组，加入浓度为30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L的苦参碱，作用48小时后采用流式细胞仪及MTT检测法检测A549细胞凋亡情况，计算生长抑制率，并采用Western Blotting和real time PCR检测PI3K、p-AKT蛋白以及PI3K、AKT mRNA表达水平，比较四组之间的差异。结果高浓度组、中浓度组、低浓度组生长抑制率和凋亡率显著高于对照组(P<0.05)，且随着浓度的升高生长抑制率和凋亡率显著升高(P<0.05)；高浓度组、中浓度组、低浓度组PI3K、AKT mRNA及PI3K、p-AKT蛋白表达显著低于对照组(P<0.05)，且随着浓度的升高PI3K、AKT mRNA及PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论苦参碱可诱导肺癌A549细胞凋亡，推测其作用机制与PI3K/Akt信号通路有关。

肺癌； A549细胞； 苦参碱； PI3K/Akt信号通路

肺癌多因肺支气管黏膜在物理、化学等致癌因素的作用下发生基因突变，导致细胞癌基因活化，抑癌基因失去活性[1]。苦参碱是中药苦参所含的主要生物碱之一，提取于苦豆子根部。有研究指出[2]，苦参碱可通过影响肿瘤细胞DNA合成，抑制肿瘤细胞增殖，发挥其抗肿瘤作用。另有研究指出[3],苦参碱可通过调控肿瘤相关基因的表达，通过影响多种通路，诱导细胞发生凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。但关于苦参碱对PI3K/Akt信号通路影响的研究较少。本研究特探究苦参碱诱导肺癌A549细胞凋亡机制以及与PI3K/Akt信号通路的关系，旨在为临床重要抗肿瘤机制的研究提供新思路，同时为肺癌的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞

人肺癌A549细胞株，由山东博德生物科技有限公司提供。

1.2 主要试剂

苦参碱，分子量为248.36，购自南京广润生物制品有限公司，避光保存，实验中现用现配所需浓度。四甲基偶氮唑蓝(MTT)，购自Sigma公司，用锡箔纸包装，避光保存备用，使用前常温下融化，有效期为一周。RPM1-1640溶液：购自济南美森特生物科技有限公司；二甲基亚砜与荧光染料均购自Sigma公司；以及标记液、孵育缓冲液、PI染液。

1.3 实验仪器

二氧化碳孵育箱：型号SANYO MCO-18M；流式细胞仪：型号BD FACSCalibur；微量移液器：型号HG211-WKYⅢ；倒置显微镜：日本奥林巴斯；离心机：德国，型号Eppendorf525L；荧光显微镜：日本奥林巴斯。培养液、培养板由Corning公司提供。

1.4 实验方法

细胞培养、传代：将浓度为4×105个/mL的A549细胞接种于96孔培养板中，每组设置6个复孔。每孔滴入180 μL，培养时间为48小时。对照组加入生理盐水，低、中浓度组及高浓度组分别加入浓度为30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L的苦参碱。

1.5 A549细胞生长抑制率及凋亡率检测方法

48小时后每孔滴入浓度为5 g/L的MTT液，共20 μL，作用时间为4小时，4小时后将培养基撇弃，加入150 μL DMSO，震荡15分钟，采用酶标仪检测每孔在490 nm的吸光度值，观察48小时后苦参碱对肺癌A549细胞的抑制情况。48小时后将细胞收集，经PBS洗涤后进行重悬，采用70%的乙醇将其固定，并将碘化丙啶(PI)加入其中进行30分钟的染色，采用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。制作贴壁细胞，并使用PBS洗涤1次，可增加适量干燥样品使细胞贴得更加牢固，使用免疫染色固定液固定细胞60分钟，再用PBS洗涤1次，加入含有0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚的PBS，冰浴孵育2分钟，采用荧光显微镜观察细胞凋亡情况，并计算凋亡率。

1.6 Real time PCR法检测PI3K、AKT mRNA表法

采用紫外分光光度计测定260 nm、280 nm OD值，取样品低温保存备用。加入79 μL DEPC水，紫外分光光度计测OD 260、OD 280，当其比值为1.8～2.0时，提示样本中RNA纯度合格。在37℃ 15分钟，85℃ 5秒为1个循环的反应条件下逆转录合成cDNA。在反应体系为20 μL，95℃ 0.5分钟，1个循环，95℃ 5秒、60℃ 34秒、40个循环，95℃ 15秒、60℃ 60秒、95℃ 15秒，1个循环的反应条件下，进行PCR扩增。将所扩增的PCR产物进行溶解度曲线分析，根据系统给出的数值，使用内参actin，计算各组PI3K、AKT mRNA的表法水平。

1.7 PI3K、AKT蛋白表达情况检测方法

根据PI3K、p-AKT蛋白质分子量配置相应的分离胶，混合均匀，置于烘箱中静置30分钟，直至水层与胶层出现明显界限，向其中灌注浓缩胶，室温静置30分钟，直至凝胶聚合。将制作的样本经SDS-PAGE电泳，转膜制作成转移“三明治”。将膜放入TBST冲洗1次，置于丽春红染色液中染色5分钟，放入盛有封闭液的容器中，封闭1小时，根据抗体说明书，使用脱脂奶粉溶液稀释一抗，将其加入到封闭容器中，放置于冰箱内过夜孵育。清除一抗，后室温下摇床孵育2小时进行二抗孵育。最后在暗盒内进行曝光鉴定。采用Quantity One凝胶图像分析软件对胶片进行分析光密度值。使用内参GAPDH条带的光密度比值表示PI3K、p-AKT蛋白表达水平。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 肺癌A549细胞生长抑制率及凋亡率比较

高浓度组、中浓度组、低浓度组生长抑制率和凋亡率显著高于对照组(P<0.05)，且随着浓度的升高，生长抑制率和凋亡率显著升高(P<0.05)，其中高浓度组生长抑制率和凋亡率最高。详见表1。

表1 四组肺癌A549细胞48生长抑制率及凋亡率比较结果(%)

注： 与对照组相比，aP<0.05；与低浓度组相比，bP<0.05；与中浓度组相比，cP<0.05。

2.2 四组PI3K、AKT mRNA表达情况比较

高浓度组、中浓度组、低浓度组PI3K、AKT mRNA表达显著低于对照组(P<0.05)，且随着浓度的升高PI3K、AKT mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，其中高浓度组PI3K、AKT mRNA表达水平最低。详见表2。

表2 四组PI3K、AKT mRNA表达情况比较结果

注：与对照组相比，aP<0.05；与低浓度组相比，bP<0.05；与中浓度组相比，cP<0.05。

2.3 四组PI3K、AKT蛋白表达情况比较

与对照组相比，苦参碱处理细胞48小时后，随浓度的增加，A549细胞可见染色质凝集、核碎裂等形态学改变，PI3K和Akt蛋白表达在细胞浆及细胞核中的均明显减弱，由棕黄色逐渐变浅，提示PI3K和Akt蛋白阳性表达下降(见图1、图2)。Western Blotting定量分析结果与此一致，显示出高浓度组、中浓度组、低浓度组PI3K、AKT蛋白表达显著低于对照组(P<0.05)，且随着浓度的升高PI3K、AKT蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。详见表3、图3。

3 讨论

肺癌是常见的恶性肿瘤，目前对于该病的治疗临床上多采用手术、放疗、化疗以及分子靶向药物治疗，但治疗效果不理想[4-5]，且毒副作用明显，尤其是化疗药物对患者骨髓造血功能有明显的抑制作用，导致患者不得不中断治疗[6-7]。

近年来，PI3K/Akt信号通路引起国内外研究人员的注意， 其传导途径为PI3K激活后在质膜上产生信使PIP3，PIP3与细胞内PH结构的信号蛋白Akt和PDKI结合，促进PDKI磷酸化AKT蛋白的Ser308，进而导致AKT激活，并通过磷酸化多种酶和转录因子等下游因子，调节细胞功能[8-9]。有关研究发现，肺癌肿瘤细胞抗凋亡的主要作用机制为PI3K/Akt信号转导通路的激活。细胞在一系列内外因素作用下，通过启动PI3K/Akt信号通路，诱导细胞增殖分化，减少细胞的凋亡[10-11]。

注：A对照组；B低浓度组；C中浓度组；D高浓度组

注：A对照组；B低浓度组；C中浓度组；D高浓度组

表3 四组PI3K、AKT蛋白表达情况比较结果

注： 与对照组相比，aP<0.05；与低浓度组相比，bP<0.05；与中浓度组相比，cP<0.05。

注：1高浓度组；2中浓度组；3低浓度组；4对照组

苦参碱属于四环的喹嗪啶类，分子骨架为2个喹嗪啶环的杂体。有研究表明[11-12]，苦参碱具有抗肿瘤作用，且可抑制多种细胞增殖，并诱导其凋亡。其主要作用机制可能为苦参碱可增强促凋亡因子的表达，同时抑制促癌基因的表达。有关研究指出,苦参碱可通过多种途径影响肿瘤细胞的增殖分化，诱导肿瘤细胞的凋亡，其中MAKP/ERK以及MAPK、JAK-STAT信号通路在作用机制中发挥重要作用[13]。此外，苦参碱可通过影响人端粒酶逆转录酶的表达对肺癌A549细胞的凋亡产生影响[14]。

本研究结果显示，对照组A549细胞株生长抑制率和凋亡率显著低于其他组，且浓度越高生长抑制率和凋亡率越高，提示药物浓度越高对肺癌A549细胞增殖的抑制作用以及促进其凋亡作用越明显。显微镜下可观察到随着药物浓度的增加，坏死细胞脱落逐渐增多，贴壁细胞逐渐减少，呈现出明显的浓度依赖性[15]。此外，本研究中苦参碱三个浓度组PI3K、AKT蛋白以及PI3K、AKT mRNA表达显著低于对照组，且随着浓度的升高表达水平显著降低，提示药物浓度越高抑制PI3K、AKT蛋白和mRNA的表达作用越强。

综上所述，苦参碱可诱导肺癌A549细胞的凋亡，其可能作用机制为通过PI3K/Akt信号转导通路，调控相关基因和蛋白的表达，且随着药物浓度的增加，生长抑制率和凋亡率以及对相关基因和蛋白的抑制作用越明显。

[1] 侯晓玮,庄兴俊,宋谦,等.CT引导经皮肺穿刺活检检测晚期非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变[J].介入放射学杂志,2013,22(2):125-128.

[2] 何光耀,谢貌,唐安洲,等.苦参碱对人鼻咽癌CNE2细胞裸鼠移植瘤生长及凋亡相关基因表达的影响[J].郑州大学学报(医学版),2014,49(2):169-172.

[3] 周娟,倪松石,贲素琴.苦参碱对人肺腺癌A549细胞增殖及HIF-10α,VEGF表达的影响[J].山东医药,2012,52(3):25-27.

[4] 蔡俊霞,谭洁,王彬,等.DC—CIK治疗43例晚期非小细胞肺癌的近期疗效观察[J].现代肿瘤医学,2014,22(1):67-70.

[5] Hsieh M J,Tsai T L,Hsieh Y S,et al.Dioscin-induced autophagy mitigates cell apoptosis through modulation of PI3K/Akt and ERK and JNK signaling pathways in human lung cancer cell lines[J].Archives of toxicology,2013,87(11):1927-1937.

[6] 敖曼,连相尧,刘承一,等.参芪扶正注射液对肺癌化疗患者造血功能和免疫功能的影响[J].山东医药,2012,52(3):60-61.

[7] 丁春杰,杨磊.参芪扶正注射液对晚期非小细胞肺癌化疗患者免疫功能的影响[J].西部中医药,2012,25(1):7-9.

[8] 殷舞,钟晓刚,黄顺荣,等.PI3K/Akt/mTOR信号通路在大肠腺瘤恶性转化中的表达及意义[J].广东医学,2013,34(2):238-240.

[9] 隋华,付晓伶,潘树芳,等.PI3K/Akt/NF-κB通路调控ABCB1/P-gp介导的人结肠癌细胞多药耐药的研究[J].中国癌症杂志,2014,24(2):106-111.

[10] Gadgeel S M,Wozniak A.Preclinical rationale for PI3K/Akt/mTOR pathway inhibitors as therapy for epidermal growth factor receptor inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer[J].Clinical lung cancer,2013,14(4):322-332.

[11] 成撒诺,徐亚丽,戴晓波,等.Krüppel样转录因子8在肝细胞癌中经PI3K/Akt通路调控VEGFA的表达[J].肿瘤,2016,34(12):1075.

[12] 鲍娇琳,陆金健,陈修平,等.苦参碱与氧化苦参碱抗肿瘤作用及其机制的研究进展[J].中药新药与临床药理,2012,23(3):369-373.

[13] 殷飞,赵军艳,姚树坤.苦参碱对SMMC-7721细胞MAPK,JAK—STAT信号通路的影响[J].肿瘤防治研究,2008,35(2):84-87.

[14] 陈晓峡,向小庆,叶红.苦参碱及氧化苦参碱抗肿瘤作用的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(11):361-364.

[15] Papadimitrakopoulou V.Development of PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitors and their application in personalized therapy for non-small-cell lung cancer[J].Journal of Thoracic Oncology,2012,7(8):1315-1326.

(本文编辑： 禹佳)

StudyontheapoptosismechanismoflungcancerA549cellsinducedbymatrinethroughPI3K/Aktsignalingpathway

ZHANGXiaowen,CUIChuanbao,ZHANGPingping,etal.

PharmacologyteachingandresearchsectionofQILUMedicalUnivercity,Zibo255213，China

Correspondingauthor:ZHANGXiaowen,E-mail:mted12@163.com

ObjectiveTo explore the apoptosis mechanism of lung cancer A549 cells induced by matrine through PI3K/Akt signaling pathway.MethodsHuman lung cancer A549 cells were cultured, which were divided into control group, low concentration group, middle concentration group and high concentration group. The cells in control group were given normal saline, and the low concentration group, middle concentration group and high concentration group were respectively given matrine with concentrations of 30 mg/L, 60 mg/L, 120 mg/L, and the apoptosis situations of lung cancer A549 cells were detected by flow cytometry and MTT detection, and the growth inhibition rates were calculated, then the PI3K, p-AKT protein and PI3K, AKT mRNA levels were detected by Western Blotting and real time PCR, the differences between the four groups were compared.ResultsThe growth inhibition rates and apoptosis rates of high concentration group, middle concentration group and low concentration group were significantly higher than those in the control group (P<0.05), which were significant increased with the increasing of concentrations (P<0.05). The levels of PI3K, AKT mRNA and PI3K, p-AKT protein in the high concentration group, middle concentration group and low concentration group were significantly lower than those in the control group (P<0.05), which were significantly decreased with the increasing of concentrations (P<0.05).ConclusionThe matrine can induce the apoptosis of lung cancer A549 cells, and the action mechanism may relate to the PI3K/Akt signaling pathway.

Lung cancer; A549 cells; Matrine; PI3K/Akt signaling pahway

山东省高等学校科技计划(J14LM55)

255213 淄博，齐鲁医药学院药理教研室

张小文(1980- )，女，硕士，讲师。研究方向：药理学。E-mail：mted12@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.08.005

2016-10-27)