饲草型小黑麦遗传多样性的ISSR分析

赵雅姣， 田新会， 杜文华

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/ 甘肃省草业工程实验室/ 中-美草地畜牧业可持续发展中心， 甘肃 兰州730070)

目前用于分析植物遗传多样性的分子标记技术主要有RFLP，RAPD，AFLP，SSR，ISSR等[1]，其中ISSR(Inter-simple sequence repeat)具有快速、高效、灵敏、重复性好、多态性丰富等优点，在种质鉴定、遗传多样性分析、亲缘关系研究等领域具有广泛应用[2]。ISSR是以微卫星序列作为引物而进行PCR扩增的DNA分子标记[3]，遵从孟德尔遗传规律，是一种显性标记[4]。ISSR无需知道DNA模板序列，可对模板中不同大小且分散在整个基因组中的DNA序列进行扩增，其标记已广泛应用于包括狗牙根(Cynodon)[5]、早熟禾(PoaannuaL.)[6]和燕麦(Avena)[7]等饲草作物上。

小黑麦(Triticale)是小麦(Triticum)和黑麦(Secale)的多倍体杂种，于1970年首先在加拿大育成。在随后几十年的发展中，全世界育种工作者共培育了500多个品系，广泛适应于不同栽培气候条件[8]。饲草型小黑麦的草产量均高于小麦和燕麦，其粗蛋白及糖分含量也明显高于小麦和燕麦[9]，我国部分地区种植的超高秆饲草型小黑麦在产量及营养价值上具有其他饲草作物不可替代的优点，对家畜生产具有重要意义[10]。目前，饲草型小黑麦在我国西南、西北等高寒山区均有种植，表现出抗逆性强、生长繁茂、生物量高、品质好等优点[11]。小黑麦的选育初衷是发展优质牧草，但其籽粒营养丰富、品质优异，因而成为粮饲兼用型作物，具有很大发展前途[12]。在小黑麦育种中大多使用相同的骨干亲本，致使小黑麦的多样性降低，遗传基础变窄，制约草产量和品质的进一步提高[13]。引进不同地区的优异种质资源是增加小黑麦遗传多样性的有效途径，同时也可深入进行小黑麦种质系统研究，为小黑麦遗传改良奠定基础。

不同小黑麦种质在形态特征上差异较小，在常规选育及种内或种间杂交时，需花费大量时间筛选出优良表现型，而表现型受环境影响较大。分子标记既可以了解小黑麦的遗传背景信息，还可以深入了解其遗传多样性，并且耗时少，可靠性高。目前，国外对小黑麦遗传多样性方面的研究较多，Tams等[14]利用SSR标记研究了欧洲冬性小黑麦的遗传多样性，Katharina等[15]利用DArT标记比较了冬性和春性小黑麦的多样性和连锁不平衡性，Mikhailova等[16]分析了小黑麦抗叶锈病多样性的田间表现，Orlovskaya等[17]利用RAPD和ISSR标记研究了俄罗斯春性小黑麦的遗传多样性。国内对小黑麦的研究主要集中在草产量[18]及品质[19]、最佳刈割期[20]及施肥[21]、抗性[22]及适应性[23]等方面，基于ISSR分子标记的小黑麦遗传多样性报道仅有1篇[24]，而且有致命缺点，即每个小黑麦材料的扩增条带为两条，其中1条为引物二聚体，无多态性，不能作为小黑麦ISSR-PCR反应体系，没有参考价值。本研究拟利用ISSR分子标记，对来自澳大利亚和国内不同区域30份饲草型小黑麦种质进行遗传多样性分析，以研究不同种质间的遗传差异及遗传背景，为小黑麦育种及ISSR分子辅助育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

参试材料为从澳大利亚悉尼大学和国内黑龙江、河北、北京、内蒙、新疆等地引进的产量性状较好的饲草型小黑麦种质。小黑麦种质及来源见表1(材料来源地即其育成地)。其中，33RD ITSN，CHEROKEE，新小黑麦4号，新小黑麦5号，北联1号，北联4号，北联5号，中拉一号为小黑麦品种，其余为小黑麦品系。所有材料均属于冬性。

表1 供试小黑麦种质及其来源Table 1 Name list and origin of Triticale genotypes

1.2 DNA提取

30份小黑麦种质待长至2～3叶时取样。取样时从每份种质中剪取8～10片幼嫩叶片，用锡箔纸包裹并置于-80℃冰箱保存。采用改良的CTAB法[25]提取基因组DNA，溶于50 μL TE中备用。用1.0%琼脂糖凝胶电泳对降解程度进行检测，使用超微量紫外分光光度计对DNA浓度和纯度进行检测，并调整DNA浓度至20～30 ng·μL-1，-20℃保存

1.3 引物及PCR扩增

采用粗略调整的小麦属植物的反应体系及PCR扩增[25]对小黑麦引物进行筛选，参考适于禾本科植物ISSR-PCR反应体系[26-27]，从中选取30条引物，进行PCR扩增，并参照引物Tm值，设定退火温度为：49，49.6，50.7，52.3，54.4，56.2，57.3，58℃，从中筛选出每个引物的最佳退火温度[28]。

反应体系采用正交设计与单因素试验相结合的方法。正交试验设计为L16(45)，对Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq DNA酶浓度进行4因素4水平试验。根据正交试验结果，选出扩增效果最佳的体系，在此基础上再对每一单因素进行细化及梯度优化，最终确定其最佳反应体系(20 μL)为：1.9 mmol·L-1Mg2+，0.2 mmol·L-1dNTPs，0.65 μmol·L-1引物，2 U Taq DNA聚合酶，PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52.3℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃再延伸7 min[28]。1.5%琼脂糖对PCR扩增产物进行凝胶检测，DM2000作标准分子量对照。

1.4 数据分析

对各引物的ISSR扩增图谱进行人工读带，根据分子标记在相同电泳迁移率(相同分子量片段)，将电泳图谱中同一位置上的条带有无进行统计，相同迁移位置的DNA带赋值为“1”，不存在的赋值为“0”。不同迁移位置的条带总数为扩增总条带数，每个种质均出现的条带位点数为共有条带数，多态性比率=(总条带数-共有条带数)/总条带数×100%。

利用POPGENE32[29]计算遗传相似性系数(GS)、遗传距离(GD=1-GS)、计算多态性比率(PPB)，生成0/1原始数据矩阵，并建立原始数据表。采用UPGMA法(unweighted pair-group method arithmetic averages，非加权配对算术平均法)进行居群间Nei遗传距离的聚类分析，并做出遗传相似系数聚类图，使用软件为NTSYS-PC(Version 2.10e)[30]。

2 结果与分析

2.1 DNA检测

30份小黑麦种质提取DNA后的检测结果如图1所示。基因组DNA加样孔清晰，条带整齐，无拖尾，表明基因组DNA样品较纯，基本无降解、无多糖、无多酚等杂质及无RNA污染。超微量紫外光分光光度计测定其OD260/OD280为1.7～1.9，OD260/OD230为2左右，符合PCR要求。

图1 小黑麦DNA电泳结果
Fig.1 Electrophoresis result of DNA on triticale

2.2 多态性分析

本研究在前期研究[28]基础上，最终筛选出12条稳定性及重复性好、多态性高且条带清晰的引物，用于30份小黑麦种质的扩增，各引物最佳退火温度及扩增结果如表2所示。12条引物在小黑麦ISSR-PCR扩增中共检测到124条扩增条带(位点)，不同引物扩增条带数不同，最少可扩增出7条(UBC857)，最多可扩增出15条(UBC815)，其中多态性条带共96条，平均每个引物扩增出8条多态性条带。多态性比率(PPB)的平均值为77.42%，其中UBC808与UBC815多态性最好，PPB值为100%。UBC807与UBC847图谱最清晰，扩增效果最好，且扩增条带数丰富，均为13条，片段大小为250～2 000 bp(图2)。说明30份小黑麦种质的多态性好，遗传变异大，能够有效揭示小黑麦种质的多态性。

表2 小黑麦ISSR分析所用引物序列和扩增结果Table 2 Primer sequences and amplified results for ISSR analysis of triticale

图2 引物UBC807(a)和UBC847(b)对30份小黑麦种质DNA的ISSR扩增图谱
Fig.2 ISSR fingerprints for the DNA samples of 30 triticale genotypes amplified by the primer UBC 807(a) and UBC 847(b)
注：M表示分子量标记；种质编号同表1
Note: M means the marker. The genotype number is the same as showed in the table 1.

2.3 遗传相似性分析

应用NTSYS2.1软件，以30个小黑麦种质和124条扩增条带数据为原始矩阵，共获得450个两两不同种质间的Dice相似系数(表3)。由表3可知，遗传相似系数变化范围在0.66～0.91之间，平均遗传系数为0.77，说明30份小黑麦种质遗传相似系数较小，各种质的亲缘关系较远。其中OH2236(29)与OH2473(30)的遗传相似性系数最大(0.91)，表明他们之间亲缘关系最近，种质来源或杂交亲本可能相同；安83-25(21)与北联3号(14)的遗传相似系数最小(0.66)，表明他们之间的亲缘关系最远，遗传差异最大，存在较高的遗传多样性。遗传相似性分析可知，供试各种质间普遍存在较大的差异性。

表3 30份小黑麦种质的遗传相似系数矩阵Table 3 Genetic similarity matrix basic on ISSR polymorphism for 30 Triticale genotypes

2.4 聚类分析

根据遗传相似系数，用NTSYSpc2.10e软件对30份小黑麦种质进行聚类分析，获得聚类图(图3)。在GS=0.765处可把30份小黑麦种质分为6类，第Ⅲ类为8809(5)；第Ⅵ类为81S37(9)；第Ⅴ类为826126(8)和北联3号(14)，遗传相似系数为0.83；第Ⅰ类为33RD ITSN (1)、CHEROKEE(2)和新麦5号(4)，其中33RD ITSN 与新麦5号的遗传相似系数较近，为0.85；第Ⅳ为北联4号(15)、PH389(19)、DH796(20)、安83-25(21)、中拉一号(22)，其中北联4号与安83-25、PH389与中拉一号的亲缘关系较近；其余种质为第Ⅱ类，其遗传相似系数为0.77～0.91，其中OH2236(29)与OH2473(30)的GS=0.91，HH124(17)与HH127(18)的GS=0.90，OH1859(26)与OH1181(28)的GS=0.87，84B-141(12)与北联5号(16)的GS=0.87，以上种质的亲缘关系较近。

图3 30份小黑麦种质的聚类树状图
Fig.3 The cluster tree for the 30 Triticale genotypes

3 讨论

3.1 小黑麦遗传多样性的ISSR分析

甘肃省定西地区位于黄土高原的黄土丘陵沟壑区，环境恶略，降水稀少，土地稀薄，适宜该区种植的谷类作物极少且效益低[31]。小黑麦具有抗病、抗逆性强，耐酸碱，适应性广，生物量及种子产量高，营养品质好，相对节水，省肥等优点，适应定西地区种植。由于小黑麦是人工杂交种且发展仅几十年，所以育成的小黑麦品种较少且遗传性状较为相似，因此，利用分子标记对小黑麦的遗传基因进行分析，探讨亲缘关系远近及其遗传多样性，对小黑麦选育及品种改良具有重要意义。

ISSR分子标记技术已广泛应用于植物的遗传多样性分析研究，并取得了较好效果。ISSR分子标记具有较丰富的多态性，可检测到植物基因组中的微小变异，将亲缘关系较近的材料区分开。在引物筛选中，尚海英等[32]在黑麦草属的35条引物中筛选出可扩增出谱带清晰的7条引物，占20%；杭焱等[33]从华山新麦草(HuaShanWildrye)的100条引物中筛选出12条，占12%；刘丽等[34]从野牛草(Buchloedactyloides)的50条引物中筛选出7条，占17%。本研究在30个引物中筛选出了12条较好的引物，占40%，说明ISSR分子标记对小黑麦具有较好的稳定性，且多态性高。

本试验利用ISSR分子标记对30份小黑麦种质进行遗传多样性分析，通过PCR扩增得到多态性差异及遗传相似系数，可反映出不同种质间的遗传距离及关系，可为选育小黑麦新品种选择亲本提供参照依据，并对杂交后代的杂种优势进行估测，提高育种效率。不同基因组DNA的多态性表现不同，采用ISSR分子标记时，三角叶黄连(Coptisdeltoidea)多态位点为73.44%[35]，紫茉莉(MirabilisjalapaL.)为92.54%[36]，新麦草(Psathyrostachysjuncea(Fisch.) Nevski)为85.70%[37]，小苍兰(FreesiarefractaKlatt)为64.62%[38]，钝裂银莲花(Anemoneobtusiloba)为55.92%[39]。本试验利用12个引物对30份小黑麦种质扩增，获得124条谱带，其中77.42%的扩增片段能够揭示出亲本间的遗传差异，表明小黑麦亲本间的遗传多样性处于中等水平，且具有较丰富的遗传基础。

30份小黑麦种质的遗传相似系数变化范围为0.66～0.91，遗传相似系数跨幅较大，遗传多样性较高，主要是因为：首先30份小黑麦种质来自不同地区，其生长环境、亲本材料及培育过程不同，导致形成不同生态类型；其次，能够申报为品种的小黑麦种质均具有遗传丰富的特点。第Ⅳ类与第Ⅴ类的遗传相似系数最小，说明该两类种质的遗传多样性较大，其中安83-25与北联3号的遗传相似系数为0.66，具有较大的遗传距离，另外，安83-25与北联3号小黑麦种质均适应甘肃省定西地区的气候条件，草产量较高，草品质较好，因此可将两者作为亲本材料进行杂交，以选育高产优质小黑麦新品种，其后代将具有较强的杂种优势。8809为第Ⅵ类，该种质与其他种质的遗传相似系数均小于0.81，说明该种质具有较大的遗传差异性，在杂交育种中具有重要地位。81S28与83P-91、826126、81S37均来自内蒙古农科院，其中81S37与其他3个种质的遗传距离较大且不属于同一类，其原因可能是基因突变，在进化过程中个别基因发生变异，且变异后仍较好地适应当地的环境并使其基因型保存下来；由于串粉而导致天然杂交；81S37与81S28、83P-91、826126本身的亲缘关系较远。

3.2 小黑麦种质的遗传多样性与地理来源

本试验的供试材料来源于澳大利亚和黑龙江、河北、北京、内蒙、新疆等地，这些小黑麦种质的遗传多样性较为丰富，遗传背景差异相对显著，但相同地区的部分种质可能由于种源地所处的环境相同，父母本相似，或引种驯化及人工选育方法相同，以及种质间的不断杂交而表现出亲缘关系较近的现象，因此聚为一类，如第Ⅱ类的18份种质中，来自中国农科院作物所的“OH”系列全部属于其中，说明“OH”系列小黑麦种质的父母本亲缘关系极为相似，其中OH2236与OH2473的遗传相似系数为0.91。第Ⅰ类中的33RD ITSN与CHEROKEE均来自澳大利亚悉尼大学，其遗传相似性系数为0.82，推测2种质可能具有相同的父母本，这与刘永财等[37]与范彦等[40]新麦草和扁穗牛鞭(Hemarthriacompressa)草种质遗传多样性的研究结果一致。北联4号与北联3号、中拉一号与OH1194等均来源于同一地区，但遗传相似性较小，GS值分别为0.76和0.72，说明遗传聚类与地理来源没有严格的一致性，这与周少云等[41]的研究结果一致。

3.3 综合分析

利用ISSR分子标记可获得清晰且多态性高的小黑麦电泳图谱，且比其他分子标记容易操作、节省时间、花费小，应用于小黑麦遗传多样性研究及不同浓度DNA水平识别较可靠。另外，小黑麦是自花授粉植物，利用ISSR分子标记分析的准确性明显高于异花授粉植物[42]。在小黑麦杂交育种中，应尽可能选择亲缘关系较远、性状较好的材料作为亲本，以提高杂交后代的杂种优势。

4 结论

参试饲草型小黑麦种质遗传多样性较丰富，利用ISSR的12条引物共检测到124条扩增条带(位点)，平均多态性比率(PPB)为77.42%。30份种质的遗传相似系数(GS)为0.66～0.91。在GS=0.765处将30份小黑麦种质分为6类，其中8809及81S37与其他种质的遗传距离最大，单独聚为一类；826126和北联3号为第Ⅴ类；33RD ITSN 、CHEROKEE和新麦5号为第Ⅰ类；北联4号、PH389、DH796、中拉一号和安83-25为第Ⅳ类；其余种质聚为第Ⅱ类。第Ⅳ类与第Ⅴ类的小黑麦种质的遗传相似系数均较小，安83-25和北联3号可以进行杂交，以选育高产优质小黑麦新品种。