畜禽干扰素—γ研究进展

叶繁翔++谭佳丽++何锦艳+叶丹+徐红贞+欧阳婧

摘要：干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的细胞因子，主要由活化的T细胞和自然杀伤（Natural killer）细胞产生。干扰素因其重要的免疫调节功能而被广泛地应用于疾病的诊断及治疗过程。本研究主要对干扰素-γ诱生、作用机制、生物学活性、畜禽IFN-γ基因多态性与疾病的关系以及畜禽干扰素开发等的研究现状进行综述，以期为畜禽干扰素-γ的深入研究及其在畜禽生产中的应用奠定一定的理论基础。

关键词：干扰素-γ（interferon-γ）；基因多态性；抗病

中图分类号：S852.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）16-3001-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.001

Research Progress of Interferon-γ in Livestock and Poultry

YE Fan-xiang， TAN Jia-li， HE Jin-yan， YE Dan， XU Hong-zhen， OU-YANG Jing

（College of Life Science of Jiangxi Science and Technology Normal University/Jiangxi Key Laboratory of Bioprocess，Nanchang 330013，China）

Abstract： Interferon-γ （IFN-γ） is a kind of cytokine which is mainly produced by activated T cells and natural killer cells. It has the functions of antiviral， anti-tumor and immune regulation. Interferon is widely used in the diagnosis and treatment of diseases due to its important immune regulatory function. This article mainly summarized interferon-γin following aspects including the production， mechanism of action， biological activity， the relationship between gene polymorphisms and diseases， and interferon development， in order to provide insight into further studies of poultry interferon-γand its application in poultry production.

Key words： interferon-γ； gene polymorphism； disease resistance

20世紀30年代，许多病毒学家在研究两种病毒感染同一宿主细胞时，发现存在两种病毒相互拮抗的现象，由此提出了病毒间相互干扰的概念。当Isaacs等[1]在1957年进行鸡胚细胞流感病毒感染试验时首次发现了一种能干扰和抑制病毒复制的细胞分泌物，故将其取名为“干扰素”。随后的1970年又因发现γ干扰素具有更强的免疫调节功能将其命名为“免疫干扰素”。Lin等[2]研究发现，来自淋巴细胞培养上清中存在一种IFN，但抗原性不同于以往发现的IFN，遂又将其区别于IFN-α和IFN-β等Ⅰ型IFN命名为Ⅱ型IFN。1980年国际干扰素委员会定义了干扰素，认为干扰素是一类在同种细胞上具有抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋白质的合成。IFN-γ主要由活化的T细胞和NK细胞产生，能够激活巨噬细胞分泌抗炎症因子、刺激MHCⅡ分子的表达，能够促进B细胞分化、产生抗体及免疫球蛋白类别转换[3，4]。自发现以来，干扰素的研究是细胞因子研究当中最为活跃、进展最快的领域之一，也是分子生物学、临床医学、免疫学、遗传学和肿瘤学等相关领域的研究热点[5]，同时畜禽干扰素-γ研究也备受关注。

1 干扰素-γ的诱生

干扰素是诱生蛋白，自然状态下干扰素基因处于沉默状态，只有经过刺激后才表达。故将能使干扰素表达的物质称为“干扰素诱生剂”，常见的干扰素诱生剂包括以下四类：①病毒[6]、细菌等病原体；②细菌内外毒素、放线菌酮等分泌物质；③细菌脂多糖（LPS）、植物血凝素（PHA）、刀豆素（ConA）[7]等有丝分裂原；④人工合成的梯洛龙、聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸（PolyI：C）等药物制剂[8]。

2 干扰素的作用机制

干扰素并不直接作用于效应分子的基因上进行调控，而是通过受体介导的信号转导系统引发一系列的生化反应，最终使效应分子基因表达，即干扰素通过与细胞膜上的特异性受体结合，引发级联性的信号放大过程，并最终将信号传递到细胞核内，对系列相关基因的表达进行调控[9]。

INF作用于细胞的经典JAK-STAT信号通路为，首先INF与细胞上的受体结合，与受体相联的JAKs对STATS磷酸化，STATS中的特异酪氨酸残基被JAKs磷酸化激活后，与磷酸化酪氨酸的Sre同源区2（SH2）相互作用形成同体或异体二聚体；然后STAT二聚体结合到基因的γ-激活序列（Gamma-activated sequence，GAS）上驱使临近基因的表达；不同的GAS偏好不同的STAT二聚体建立特异性反应；此外，STATI-2异体二聚体和STAT1同体二聚体都可以结合到一种干扰素调节因子（interferon regulatory factor，IRF）家族成员p48上，组成一个三体结构物；STATI-2异体二聚体与p48结合而成的三体结构称INF激活的基因因子3（IFN-stimulated gene factor3，ISGF3），它同一个结构上与GAS完全不同的IFN激活的调节序列（IFN-Stimulated regulatory elements，ISREs）结合[10-12]。endprint

继JAK-STAT信号通路被发现介导干扰素γ引发的各种细胞反应后，研究人员在此基础上获得了一些新的发现，原来除了STAT1依赖途径外，还有不依赖STAT1途径，且两种途径在IFN-γ介导的各种生物学反应达到平衡[13]。近年来有研究表明IFN-γ引发的信号通路除了JAK-STAT信号通路外，还有一些其他的物质，诸如MAP激酶、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3-K）、钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶（CaMKII）和核转录因子kappa B（NF-κB）同样参与了JAK-STAT信号通路，或者形成一些新的信号通路发挥作用[14，15]。

3 干扰素的生物学活性

Ⅰ型干扰素主要包括α型和β型，IFN-α及IFN-β共用同一類受体，对病毒感染进行免疫应答并产生免疫抗体蛋白，而Ⅱ型干扰素只包含一种，即IFN-γ，其作用与Ⅰ型干扰素不同，除产生一系列免疫应答反应外，还具有免疫系统调节的功能，其抗病毒活性不是杀灭病毒而是抑制病毒的活性。因其既对DNA病毒有抑制作用又对RNA病毒有抑制作用，故将其称为“广谱病毒抑制剂”。除此之外，IFN-γ还可以与细胞外基质相连的形式存在，通过旁邻方式控制细胞的生长，进而起到抑制肿瘤生长的作用[16]。

3.1 抗病毒作用

抑制病毒的繁殖和生长是干扰素的基本功能之一，干扰素对高等生物的生存至关重要，因为它们为抗御病毒的侵害提供了第一道防线，比免疫反应要早几小时至几天的时间。干扰素受体缺损的小鼠对病毒的感染特别敏感，由此可看出干扰素抗病毒作用的重要性。干扰素抗病毒具有广谱性，但对细胞抗病毒作用是间接的，而且是非特异性的。当干扰素与细胞表面的干扰素受体结合后，可诱导细胞内产生有酶活性的抗病毒蛋白（AVP）。已知的AVP至少有3种，蛋白激酶、磷酸二酯酶和2-5A合成酶，前2种能破坏细胞核糖体转译病毒蛋白质，后一种降解mRNA，有的AVP还能抑制转录酶的活性，阻止mRNA的形成，还有的能抑制病毒DNA和RNA的合成。因此可以说干扰素是通过AVP间接地抑制病毒复制而达到抗病毒作用的[17]。

3.2 干扰素抗肿瘤功能

研究表明MHC在肿瘤免疫方面起着重要作用，恶性肿瘤细胞常有MHC表达降低或丢失的现象。肿瘤细胞MHC抗原的丢失是肿瘤细胞逃避机体免疫监视的原因之一。而近来研究发现INF能诱导细胞MHCⅠ、Ⅱ类抗原的表达，并能使MHC表达降低或丢失的恶性肿瘤细胞MHC表达增强，也可使MHC表达无降低或丢失的恶性肿瘤细胞的MHC表达进一步增强，从而增强肿瘤的免疫原性及T细胞对肿瘤细胞的识别能力，增强对肿瘤抗原的提呈作用，激活机体免疫系统杀伤肿瘤细胞[18]。

IFN调节MHC表达主要在转录水平上，其可加速MHC转录过程，并增强其表达。Michael等[19]通过检测去除IFN作用后转录下降速率、稳定状态下的mRNA水平及细胞膜表面蛋白表达水平的高低。证明IFN-γ诱导MHCⅡ类抗原表达主要是作用于转录水平，而不是转录后水平。因Ⅰ型干扰素及Ⅱ型干扰素受体不同，且对MHC启动子的要求也不同，因而IFN对MHC的诱导表达作用有强弱。

3.3 IFN-γ的免疫调节作用

Ⅰ型干扰素可增强主要组织相容性复合物Ⅰ（MHCⅠ）类分子表达，而强烈抑制MHCⅡ类分子表达，而Ⅱ型干扰素可促进MHCⅡ类分子表达，两类干扰素的协同调节作用，使机体处于最佳免疫应答状态。此外INF-γ的生成可促进Th0细胞向Th1细胞分化，而抑制Th2细胞的生成，由于Th1细胞和Th2细胞分别介导机体细胞免疫和体液免疫，因此 INF-γ可根据不同病原感染，与其他细胞因子（如IL-4等）共同作用对机体进行免疫干预，实现免疫系统防御功能[20]。

IFN-γ能刺激MHCⅠ及MHCⅡ表达上调，并通过抗原呈递细胞（Antigen-presenting cells，APCs）提高抗原呈递效率。除此之外，IFN-γ还参与淋巴细胞的成熟及分化过程。并且还能增强自然杀伤细胞的活力、调控B细胞分泌抗体[21]。

4 畜禽IFN-γ基因多态性与疾病发生的相关研究

有关人IFN-γ基因多态性方面的研究较多，而畜禽IFN-γ基因多态性与综合抗病力报道较少，中国农大张勤等人采用全基因组关联性分析方法（Genome-wide association study，GWAS）对猪种的细胞活性因子及免疫球蛋白G等免疫相关性状做了一系列的分析，其中包括利用猪SNP 60K芯片发现了62 163个单核苷酸多态性位点（Single nucleotide polymorphism，SNP），接着采用单个位点回归模型筛选出了46 079个单核苷酸多态性位点。最后找出了与免疫性状相关的32个显著性SNP位点，其中与IFN-γ水平显著性相关的SNP 有6个，17个SNP位于之前报道过的免疫相关QTL（Quantative Trait Loci）区域，此项研究为探究影响猪免疫力性状的因果突变位点奠定了基础[22]。此外该课题组还发现IRF1（Interferon regular factor 1）及IRF2基因的SNP与血清中IFN-γ的表达量显著相关，认为其是与猪免疫力性状相关的候选基因[23，24]。

王大力等[25]采用PCR-SSCP技术和最小二乘法对猪IFN-γ基因多态性及部分免疫指标进行了关联分析，其试验结果显示，猪IFN-γ基因的内含子1内T825C位点多态性对血清IgG含量有着显著影响，且3种基因型间AB-型要高于AA-型，并达到了显著水平，BB-型高于AA-型但差异不显著；而T2370C位点对Ig M含量的影响CC-型显著高于CD-型和DD-型；G5301A位点多态性对IgG含量的影响EE-型显著高于EF-型。云南农业大学冀斌[26]对红原鸡IFN-γ启动子多态性及MHC单倍型对禽流感免疫效果的影响进行了研究。研究表明该实验所取的两类基因均有丰富的多态性，其中IFN-γ-316A/G基因型与高致病性禽流感病毒HPAIV特异性抗体水平存在关联，结果显示A等位基因携带个体可能具有较强的HPAIV抗病力。endprint

5 畜禽干扰素-γ开发的相关研究

目前国内外对于畜禽干扰素开发应用研究主要是利用基因工程的技术手段构建表达载体，并导入受体细胞或者基因工程菌中以获得其蛋白产物作疫苗佐剂用，下面主要以猪、鸡、鸭干扰素研究为例进行阐述。

5.1 猪干扰素-γ开发

中国是世界养猪大国，在猪的养殖过程中易受流感病毒、口蹄疫病毒等的感染，使养殖业遭受巨大的损失，因此开发出高效的干扰素疫苗是当务之急。潘晓梅等[27，28]将猪IFN-γ基因克隆至原核表达载体pET-30a，构建PET-30a-pIFN-γ重组表达载体，导入寄主菌BL21（DE3）后用IPTG诱导表达，将表达后产物使用镍亲和层析柱纯化，纯化后的产物经SDS-PAGE及Western blot分析证实为高纯度的重组pIFN-γ，经过一系列生物活性实验发现重组pIFN-γ能有效抑制伪狂犬病毒和口蹄疫病毒的复制，并在高浓度时可诱导传代细胞凋亡。赵伟鸽等[29，30]采用同样的技术路线纯化获得了高纯度重组IFN-γ蛋白。其研究为猪IFN-γ相关的基因工程生物制品的开发奠定了可靠的基础。

虽然IFN-γ干扰素疫苗在对抗病毒方面取得了一定的效果，但毕竟其抗病毒能力不及IFN-α及IFN-β，故Kim等[31]将猪α干扰素及γ干扰素基因一起剪接到腺病毒DNA上形成能够分泌α干扰素及γ干扰素的重组腺病毒，此法得到的重组腺病毒能快速、高效获得干扰素蛋白以对抗手足口病病毒的感染。

5.2 禽类干扰素的开发

近年来禽流感蔓延世界各地，不仅给养殖业造成了巨大的损失，而且还威胁人的生命。因此研发高效的禽类干扰素是未来干扰素开发的发展方向。纵观国内外禽类干扰素的开发，主要集中在鸡和鸭的干扰素上，对重组鸭IFN-γ的生物活性分析显示，其对机体的刺激作用远远低于重组鸡IFN-γ的作用，仅为其活性的1/16，造成刺激作用差别如此之大的具体原因尚未知，推测可能与干扰素的结构和作用机制有关[32]。

目前重组干扰素-γ在鸡和鸭中抗病毒研究效果很好，Sawant等[33]将鸡IFN-γ基因及IL-4（interleukin-4）基因连接到pVIVO2载体上，然后通过RT-PCR体外检测IFN-γ基因及IL-4（interleukin-4）基因的表达，将重组DNA导入到鸡受体细胞内发现能产生对抗新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）的抗体。而且IFN-γ基因重组载体导入细胞后细胞免疫反应增强。

当前鸭IFN-γ的主要应用体现在对鸭乙型肝炎病毒和H11N9 AIV的防治上。鸭IFN-γ具有较好的治疗鸭乙型肝炎治疗效果，且鸭肝炎治疗模型有着作为人类乙肝治疗模型的开发潜力。Saade等[34]为提高基因疫苗的效力，将IL-2及IFN-γ两种细胞活性因子基因分別连接到质粒上与DHBV疫苗混合后后将其注射到新生鸭体内，在第21周的时候发现注射了鸭IFN-γ的新生鸭乙肝病毒数明显减少，并且注射了鸭IFN-γ及IL-2的鸭子分别有57%和25%个体已经检测不到病毒DNA的存在了。研究者由此得出结论IFN-γ基因与DNA疫苗共同作用可以提高疫苗的效力，有助于对抗鸭乙型肝炎病毒。

研究人员通过克隆分析鸭IFN-γ基因序列，发现鸭与鸡的IFN-γ核苷酸序列有着80%的同源性，而与其他哺乳动物的同源性只有21%～34%，这说明了禽类γ-干扰素基因有效编码区是高度保守的，为今后制备通用型的禽类Ⅱ型干扰素提供了基础条件[35]。

6 展望

目前国内外学者对畜禽干扰素-γ的各种机理及其在畜禽抗病中的应用开展了许多卓有成效的研究，但目前尚未真正揭示畜禽干扰素-γ的作用机理，畜禽干扰素-γ在畜禽生产中的应用也尚需时日。但随着现代分子生物学技术的迅猛发展，尤其是现代组学、系统生物学等新型技术的使用，相信畜禽干扰素-γ的各种机理将得到很好地解析，同时结合现代免疫学技术的使用也必将使畜禽干扰素-γ造福于畜禽生产实践。

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