硫酸二乙酯诱变螺旋霉素高产菌株的选育

吴 阳，武 培，赖 珅，张九锋，张小红

(1.西北农林科技大学，陕西 杨凌 712100；2．天方药业有限公司，河南 驻马店 463000)

硫酸二乙酯诱变螺旋霉素高产菌株的选育

吴 阳1,2，武 培2，赖 珅2，张九锋2，张小红1*

(1.西北农林科技大学，陕西 杨凌 712100；2．天方药业有限公司，河南 驻马店 463000)

以一株螺旋霉素生产菌株为出发菌株，使用硫酸二乙酯(DES)处理进行诱变，获得四株效价较高的突变株，其中有一株经过5代后遗传性状稳定。该菌株在摇瓶试验中能提高效价约6.5%左右，发酵生产中能提高放罐效价6%左右，该高产菌株的获得对提高螺旋霉素发酵生产效率有着重要的意义。

螺旋霉素；DES；诱变

螺旋霉素(Spiramycin)为16元大环内酯类抗生素，于1954年由法国Rhone-Poulenc实验室从Streptomces ambofaciens的代谢产物中分离而得[1]。为白色或微黄色粉末，微有味；微吸湿；易溶于乙醇、丙醇、丙酮和甲醇，难溶于水。螺旋霉素具有强大的体内抗菌作用和抗菌后效应(PAE)，能够增强吞噬细胞的吞噬作用，其在组织细胞内浓度较红霉素高，而副作用小于红霉素。可用于治疗由革兰阳性菌和某些革兰阴性菌引起的耳、鼻、喉和呼吸道感染。螺旋霉素对耐青霉素的致病菌也具有较好的疗效，在现代生活中有着广泛的用途。本实验以一株螺旋霉素生产菌高产菌株为出发菌株，使用硫酸二乙酯(DES)进行诱变处理，通过摇瓶和放罐培养中的效价检测，以期筛选获得高产菌株，为进一步提高螺旋霉素的发酵生产效率提供菌株。

1 材料

1.1 仪器设备

回转式摇床机、1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、EclipseE200光学显微镜(日本Nikon公司)。

螺旋霉素链霉菌G215，由天方药业有限公司提供。

1.3 培养基

斜面培养基(%)：淀粉4.0，黄豆饼粉2，氯化钠0.2,玉米浆0.7，碳酸钙0.6，琼脂2.0；121～123℃灭菌30min。

摇瓶种子培养基(%)：淀粉4.0，黄豆饼粉2，氯化钠0.2,玉米浆0.7，碳酸钙0.6；121～123℃灭菌30min。

摇瓶发酵培养基(%)：淀粉5.0，黄豆饼粉2.5，氯化钠0.6玉米浆1.2，碳酸钙1.0；121～123℃灭菌30min。

15 L发酵培养基(%)：淀粉5.0，黄豆饼粉2.5，氯化钠0.6玉米浆1.2，碳酸钙1.0；121～123℃灭菌30min。

2 方法

2.1 摇瓶种子培养

至2017我省栽培面积为50余万亩，产量约17万吨，种植面积居全国第4位。其中修文县、水城县、大方县、福泉市等猕猴桃商品生产基地。目前，我省主栽红肉品种（“红阳”猕猴桃）和绿肉品种（“贵长”猕猴桃），此外，还有新种植的黄肉品种（“金圆”猕猴桃）等。猕猴桃的成熟期因其特性而异和地域存在差异，早熟的品种如红阳猕猴桃一般集中在8月底成熟，中晚熟的品种如“贵长”和“米良一号”均在10月上旬成熟。

温度(27.5±0.5)℃、时间46 h，摇床转速220 r/min，湿度45%～60%。

2.2 摇瓶发酵培养

温度(27.5±0.5)℃、时间120 h，摇床转速220 r/min，湿度45%～60%。

2.3 15 L发酵培养

温度(27.5±0.5)℃、时间120 h，起始转速220 r/min，溶氧≥30%，根据溶氧调整转速。

2.4 效价检测方法

采用高效液相色谱法[2],螺旋霉素标准品购自中国药品生物制品鉴定所。

2.5 DES的诱导过程[3]

(1)取DES原液0.4 mL于无菌试管中，加入少量乙醇使其溶解，再加入0.1 mol/L、pH值7.2的磷酸缓冲液19.6 mL，配制成体积分数为2%的溶液。

(2)用0.1 mol/L、pH值7.2的磷酸缓冲液将G215的新鲜斜面洗下，制成菌悬液，取等体积的2%DES溶液和菌悬液混合。

(3)在27～29℃下振荡处理20～40min。

(4)诱变处理后加入2%的Na2S2O3溶液0.5 mL终止反应。

(5)将菌悬液以生理盐水至107/mL涂布平板，经过培养后，挑取单菌落进行筛选[4]。

3 结果与分析

3.1 突变菌株的平均效价

经过摇瓶验证后共挑出四株效价较高的正突变株其分别为G21532(27℃，50min)，G21557(28℃40min)，G21579(28℃30min)，G21596(29℃30min)其平均效价与对照效价相比结果如表1。

表1 突变菌株的平均效价Table 1 The average titer of mutant strains

3.2 突变菌株经过五代传递后的平均效价

将所得的4株正突变株经过五代培养，其各代的平均效价见表2。从表2可以看出G21532和G21579菌株经过三次传代后遗传性状已不稳定，G21596与对照菌相比已无优势，只有G21557突变株经过五代传递后遗传性况较为稳定，但也略有下降，因此最终选定G21557为一较为稳定的菌株。

表2 突变菌株经过五代传递后平均效价对比Table 2 Average titer of the mutant strains after five generations of transmissio

3.3 突变株的稳定性验证

利用15 L发酵罐对突变菌株G21557进行放罐发酵试验，以验证其稳定性，经过三批次平行试验，其平均放罐效价见表3。从表3可以看出，G21557菌株在15 L发酵罐平均放罐效价较生产菌高出6%左右，且表现稳定。

表3 15 L发酵罐稳定性验证Table 3 Stability verification of 15L fermentor

4 结论

采用DES在28℃40min诱变，获得4株效价较高的正突变株，进一步筛选得到一株能够稳定传代五代的正突变株G21557，其在15 L发酵罐中的平均放罐效价较生产菌高出6%左右，且表现稳定。

从抗突变株的稳定考察结果显示，经三代以后稳定性有一定的退化。因此在以后的使用和菌种保藏过程中，要控制在传代在三代以内，及时做好菌种的分离纯化工作，使菌株始终保持在稳定的高产状态。

[1] 罗 俊,高淑红,陈长华,等.甲基化试剂对螺旋霉素发酵的影响[J].化学与生物工程,2011,28(5):46-50.

[2] 刘俭国,谢书琴,李翠萍,等.林可霉素发酵中生物氮素的替代作用[J]新课程学习,2012(5):8-9.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].2005年版(二部).北京：化学工业出版社，2005：531.

[4] 何建勇. 发酵工艺学[M]. 2版.北京：中国医药科技出版社，2009:25.

[5] 赖 珅,李维平,朱义斌,等.紫外线-氯化锂复合诱变吉他霉素高产菌株的选育[J].广东化工,2015,42(7):13-14.

(本文文献格式：吴 阳，武 培，赖 珅，等.硫酸二乙酯诱变螺旋霉素高产菌株的选育[J].山东化工,2017,46(11):49-50.)

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Breeding of DES Mutagenesis of Spiramycin Producing Strain

WuYang1,2,WuPei2,LaiShen2,ZhangJiufeng2,ZhangXiaohong1*

(1.Northwest A&F University, Yangling 712100,China; 2.Topfond Pharmaceutical Co.,Ltd., Zhumadian 463000,China)

A spiramycin-producing strain was mutated by dealing with diethyl sulfate (DES) in this study. Four hyper-producing mutants were obtained and one of them was still s
Table after five generation. The spiramycin titer produced by this mutant was increased approximate 6.5% in shaking flask cultivation and approximate 6.0% in scale-up fermentation,respectively.The obtained hyper-producing mutant is very significant for enhancing the spiramycin production.

spiramycin;DES;mutagenesis

2017-04-04

吴 阳(1981—)，男，河南驻马店人，硕士研究生，工程师，主要从事抗生素发酵工作；*通讯作者：张小红(1968—)，女，陕西商州人，博士，副教授，硕士生导师，副研究员，主要研究方向：经济植物的组织培养及微体繁殖技术，植物细胞工程与作物遗传改良。

TQ465.5

A

1008-021X(2017)11-0049-02