蓖麻RcSCP基因克隆与生物信息学分析

冯紫洲+刘春梅+衡宝山+张继星+陈永胜+王云+刘海臣+穆莎茉莉+冀照军+霍红雁

摘要：植物的丝氨酸羧肽酶（serine carboxypeptidases，简称SCP）是一类属于α/β水解酶家族的蛋白酶，在许多生化途径（包括次生代谢产物的生物合成、催化酰基转移、除草剂共轭、种子萌发相关蛋白质的降解过程）中起着重要作用。丝氨酸羧肽酶基因是植物的一种抗逆基因，在植物生长发育及抵抗逆境方面发挥着重要作用。蓖麻作为重要的油料作物，用途广泛。本研究利用cDNA末端快速克隆（RACE）方法克隆蓖麻RcSCP基因的3′端、5′端片段，最后设计全长引物获得蓖麻RcSCP全长序列，并对其进行生物信息学分析。结果表明，丝氨酸羧肽酶蛋白基因的cDNA完整开放阅读框序列为1 377 bp，推测它可编码458个氨基酸；蓖麻RcSCP蛋白含有丝氨酸羧肽酶蛋白家族保守区，预测它定位于细胞质中。

关键词：蓖麻；RACE；丝氨酸羧肽酶；克隆

中图分类号： S565.601文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）12-0027-04

是一类属于α/β水解酶家族的蛋白酶，在植物生长发育过程中参与多肽和蛋白质的加工、修饰、降解等多个重要环节，并且在许多生化途径包括次生代谢产物的生物合成、催化酰基转移、除草剂共轭、种子萌发相关蛋白质降解过程中起着重要作用[1]。目前，已从多种植物中分离得到SCP蛋白及丝氨酸羧肽酶类蛋白（serine carboxypeptidases-like proteins，简称 SCPLs）[2-4]。SCP基因是一种抗逆基因，在植物生长发育及抵抗逆境方面起着重要作用。叶玲飞通过对水稻耐旱方面的研究发现，水稻OsSCP基因缺失会导致植株耐旱性和耐高温性降低[5]，表明SCP基因在耐旱、耐高温方面发挥重要作用；刘丽等将玉米ZmSCP基因导入到烟草中发现，转基因烟草的抗病性、耐盐性、抗氧化性均有提高，且其自身防卫基因的表达量也有明显升高[6]，这些均表明SCP基因在植物抵抗逆境方面起着重要作用。

蓖麻（Ricinus communis L.）是世界十大油料作物之一，是双子叶一年生或多年生大戟科蓖麻属草本植物[7]。蓖麻原产于非洲，属热带多年生灌木，我国的蓖麻由印度传入，至今已有1 400多年的历史[8]。蓖麻有700多种工业用途，主要用途是从蓖麻籽粒中提取蓖麻油[9]。蓖麻根系发达，枝叶生长量大，能在沙化土壤中生长，起到防风固沙的作用。蓖麻育种的研究主要集中在诱变育种和杂交育种方面，已育成一批旨在提高产量和改善品质的新品种，在生产上取得显著的成绩[7]。然而针对抵抗逆境育种的研究很少，关于蓖麻抗逆相关基因功能及抗逆分子育种的研究很少。研究表明，SCP在植物抵抗逆境方面起重要作用。本研究以蓖麻为材料，采用cDNA末端快速克隆（rapid-amplification of cDNA ends，简称RACE）等技术，获取蓖麻丝氨酸羧肽酶基因RcSCP，并进行生物信息学分析，为进一步研究RcSCP基因的转化及功能验证奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

蓖麻种植于内蒙古民族大学植物生物技术实训室，品种为通蓖5号，取新鲜叶片为供试材料。Ex Taq DNA聚合酶、克隆载体pMD18-T、3′RACE和5′RACE试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，感受态细胞JM109保存于笔者所在实验室，其他试剂均为国产分析纯。

1.2蓖麻叶片总RNA的提取及引物设计

使用改良的TRIzol提取法提取总RNA[10-11]，几乎没有DNA和蛋白质的污染，其纯度较高且具有较好的效果。采用RACE法克隆蓖麻SCP基因cDNA全长。根据其他植物上的NHX蛋白的保守序列设计，利用Primer Premier 5.0软件，设计3′RACE简并引物3F1、3F2；结合已经克隆得到的蓖麻SCP 3′端基因片段，设计5′RACE特异性引物5F1、5F2；采用DNAMAN软件对测定的核苷酸5′端、3′端序列进行电子序列的拼接合并，从而获得cDNA全长，在该基因编码区域的两端设计全长特异性引物F、R。

1.4蓖麻SCP基因生物信息学分析

对测序结果进行分析，确定克隆获得蓖麻SCP基因 cDNA 序列完整开放阅读框。利用SWISS-Model、DNAMAN、WoLF PSORT等生物学软件进行生物信息学分析。

2结果与分析

2.1蓖麻叶片总RNA活性的检测

将提取好的蓖麻总RNA用DEPC水进行10倍稀释，然后进行琼脂糖凝胶电泳（图1），并检测其纯度D260 nm/D280 nm值=2.10，纯度较好，满足下一步试验要求。

2.2蓖麻RcSCP基因克隆

采用RACE法克隆蓖麻SCP基因，利用設计的3′端、5′端引物及cDNA全长特异性引物进行扩增，最后得到蓖麻SCP基因cDNA全长1 377 bp的片段（图2），命名为RcSCP（GenBank 登录号：KX267676）。

2.3蓖麻RcSCP基因生物信息学分析

利用DNAMAN软件对获得的蓖麻RcSCP基因全长序列进行分析。该序列包括1 377 bp完整的开放阅读框，可推测编码458个氨基酸的多肽。该多肽的分子量为51.245 ku，等电点（pI值）为5.67，pH值7.0时电荷为-6.29。预测 RcSCP 基因的保守区，使用美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站的保守区分析（conserved domains）（http：//www.ncbi.Nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb/cgi）功能，结果表明，蓖麻RcSCP含有丝氨酸羧肽酶蛋白家族保守区，表明RcSCP与这些家族的蛋白具有相似的功能，是蓖麻的一种丝氨酸羧肽酶蛋白（图3）。运用SOPMA软件预测蓖麻RcSCP蛋白的二级结构，结果表明，该蛋白的α-螺旋为31.88%，延伸链为27.29%，β-转角为11.14%，无规则卷曲为26.69%（图4）。利用在线程序SWISS-Model的自动模式对该蛋白的三级结构进行预测分析，得到该蛋白的三级结构（图5）。利用DNAMAN软件对蓖麻RcSCP与大豆（Glycine max，XP_003531913.1）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，NP_564298.1）、麻风树（Jatropha carcas L.，XP_012088729.1）的丝氨酸羧肽酶蛋白的氨基酸序列进行对比，同源性分别为77.66%、7679%、8639%（图6）。endprint