无核葡萄自交胚挽救技术研究

田淑芬，温晓敏,2，张娜，月丫,2，路凤珍,2

（1. 天津市设施农业研究所/天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室，天津 300192；2. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387）

无核葡萄自交胚挽救技术研究

田淑芬1，温晓敏1,2，张娜1，月丫1,2，路凤珍1,2

（1. 天津市设施农业研究所/天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室，天津 300192；2. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387）

本文以二倍体种子败育型无核品种奥迪亚无核、红宝石无核、希姆劳特、无核白鸡心自交胚珠为材料，分析亲本基因型、取样时期、胚发育培养温度对无核葡萄胚挽救效果的影响。结果显示：亲本选择对胚挽救效果影响显著，不同品种自交胚发育率和萌发率从高到低为：奥迪亚无核自交、红宝石无核自交、希姆劳特自交、无核白鸡心自交；不同品种自交最佳取样期不同，奥迪亚无核、希姆劳特自交最佳取样期为授粉后54 d，红宝石无核自交胚珠最佳取样期为授粉后61 d；奥迪亚无核、红宝石无核的自交胚珠在25 ℃培养的胚发育率都显著高于4 ℃条件下胚发育率，胚珠在低温下培养会抑制胚的发育。

无核葡萄；自交育种；胚挽救

无核葡萄因食用方便深受广大消费者喜爱，选育品质优良的无核葡萄新品种已成为当前国内外葡萄育种的重要目标之一[1]。以无核品种为亲本培育新品种，避免使用激素进行无核化处理对植株正常生理周期的干扰和对葡萄果实品质的影响。但以无核品种为亲本杂交胚易败育，胚挽救技术较传统杂交育种扩大了亲本的选择范围，提高了后代无核率，可缩短育种周期[2-4]。随着科学技术的发展，胚挽救技术已成为无核葡萄主要育种方法之一。

在胚挽救育种研究中，对幼胚成苗率的影响因素如亲本选择、取样时期、基本培养基种类、外源添加物、移栽方法等对胚挽救育种效果的意义重大。国内很多学者闫爱玲、唐冬梅等[5-9]均做过很多工作，并取得了显著成绩。本研究以二倍体种子败育型无核品种奥迪亚无核、红宝石无核、希姆劳特、无核白鸡心自交胚珠为材料，分析亲本选择、取样时期、胚发育培养温度对无核葡萄胚挽救效果影响。探索亲本选择、取样时间、胚发育培养温度对胚挽救效果的影响，旨在为无核葡萄胚挽救育种的亲本选择、培养方法、培养条件提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2016年4～12月在天津市农业科学院葡萄研究中心武清试验基地、天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室进行。供试材料为4种无核葡萄：奥迪亚无核、希姆劳特、红宝石无核、无核白鸡心。

1.2 试验方法

1.2.1套袋自交

花前1～3 d选择4个品种葡萄各15穗，进行疏花套袋。

1.2.2幼果采集

授粉33 d后开始，每7 d采摘1次自交幼果，每次150粒，共采摘5次。剪去果柄，自来水冲洗15 min。在超净工作台消毒：先用75%酒精冲洗1次，用无菌水冲洗1次，放入次氯酸钠中浸泡3 min，再用无菌水冲洗3次。

1.2.3胚发育阶段胚珠培养

消毒后，将取出的胚珠接种在Nitsch+1.5 mol/L IAA+0.5 mol/L 6-BA+0.5 mol/L GA3+60 g/L蔗糖+5 g/L琼脂+1 g/L活性炭培养基（pH=5.8）上进行胚发育培养。并将这些自交胚珠分别在25 ℃、4 ℃条件下培养。

1.2.4胚萌发阶段胚培养

培养60 d后，在超净工作台上对胚珠进行剥胚，然后接种到胚萌发培养基WPM+0.2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+5 g/L琼脂+1.5 g/L活性炭（pH=5.8）中培养，30 d后调查。剥胚统计胚发育情况。若解剖镜下看到亮白色胚，则胚发育；若无亮白色胚（胚珠内无胚或胚褐化），则胚败育。

胚发育率/%=（发育胚数/接种胚珠数）×100；胚萌发率/%=（萌发胚数/接种胚珠数）×100。

2 结果与分析

2.1 亲本选择对幼胚生长发育的影响

从表1可以看出，胚发育率和胚萌发率由高到低为：奥迪亚无核自交＞红宝石无核自交＞希姆劳特自交＞无核白鸡心自交。不同无核品种自交，胚挽救难易程度差异大，说明亲本的选择对胚挽救效果影响显著。

2.2 不同杂交组合取样时期的确定

杂交胚珠在授粉33 d后，分5次取样接种。统计不同取样时期的胚珠发育率与幼胚萌发率。由表2可知，随着红宝石无核自交胚珠随着取样时间的推迟，胚发育率从0.65%逐渐增大至14.29%，胚萌发率同样逐渐提高，到花后61 d达到9.64%，说明在花后61 d取样进行胚挽救更为有效。奥迪亚无核、希姆劳特自交胚珠均在授粉后54 d取样，胚发育率和萌发率均达到最高，说明在花后54 d取胚珠进行胚挽救更为有效。无核白鸡心取样期胚发育率和萌发率都极低，萌发、发育胚数少不能说明其最佳取样期。

2.3 低温培养对幼胚发育率的影响

奥迪亚无核、红宝石无核的自交胚珠在25 ℃培养的发育率都显著高于4 ℃条件下胚珠发育率（表3）。说明胚珠低温培养会抑制胚发育。

表1 亲本选择对幼胚生长发育的影响

表2 取样时期对离体胚珠培养生长发育的影响

表3 不同培养温度对胚珠发育的影响

3 讨论与结论

胚挽救技术是无核葡萄杂交育种的有效方法。不同无核品种自交，胚挽救难易程度差异很大，可能与不同无核品种种痕残留程度有关，亲本选择对胚挽救效果影响显著[10-13]。本研究表明，4种无核葡萄做亲本，胚挽救由易到难顺序为：奥迪亚无核、红宝石无核、希姆劳特、无核白鸡心，无核白鸡心极难胚挽救成功，奥迪亚无核和红宝石无核是胚挽救育种的好材料。接种时期是影响无核葡萄胚挽救的关键因素之一[9,14-17]，过早取样胚发育不良，过晚取样胚已经败育无法成苗，本试验中无核葡萄胚珠发育率随取样时间的推移先增加后下降。普遍认为不同杂交组合最佳取样期不同，与本试验研究相符。唐冬梅、徐海英等[6,9]均认为胚珠发生败育的时期与母本选择密切相关，本试验为以奥迪亚无核、红宝石无核、希姆劳特为母本的胚挽救育种取样期确定提供了依据。一般而言，低温有助于打破种子的休眠，而对于从正生长发育的果实中获得的胚珠来说，是否需要经低温处理打破休眠目前值得探讨和研究[18-19]。郭修武等[20]认为，低温处理有利于胚发育，而唐冬梅[6]认为，低温对幼胚发育不利，本试验结果与唐冬梅观点一致。

本试验结果表明：为提高胚挽救杂交育种效率，应优先选择奥迪亚无核、红宝石无核为亲本；奥迪亚无核、希姆劳特为母本杂交胚珠选择授粉后54 d取样，红宝石无核为母本杂交胚珠在授粉后61 d取样；在25 ℃下进行胚发育培养比较合适。

[1] 王爱玲, 王跃进, 唐冬梅, 等. 提高无核葡萄胚挽救中幼胚成苗率的研究[J]. 中国农业科学, 2010, 43(20): 4238-4245.

[2] RAMMING D W, EMERSHAD R L. In-ovule embryo culture of seeded and seedless Vitis vinifera L[C]//Hortscience. 701 North Saint Asaph Street, Alexandria, Va 22314-1998: Amer Soc Horticultural Science, 1982, 17(3): 487.

[3] TIAN L L, WANG Y J, NIU L, et al. Breeding of disease-resistant seedless grapes using Chinese wild Vitis spp. I. In vitro embryo rescue and plant development[J]. Scientia Horticulturae, 2008, 117(2): 136-141.

[4] DHEKNEY S A, LI Z T, GRAY D J. Factors influencing induction and maintenance of Vitis rotundifolia Michx. embryogenic cultures[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2011, 105(2): 175-180.

[5] 闫爱玲, 孙 磊, 王慧玲, 等. 无核葡萄‘Kismis’胚挽救技术研究[J]. 中国果树, 2016, 35(6): 29-31.

[6] 唐冬梅, 王跃进, 赵荣华, 等. 无核葡萄胚挽救中影响胚发育的因子[J]. 中国农业科学, 2009, 42(7): 2449-2457.

[7] 屈田田, 张剑侠, 骆强伟, 等. 无核葡萄抗寒抗病胚挽救育种应用研究[J]. 果树学报, 2017, 34(2): 157-165.

[8] 牛茹萱, 张剑侠, 王跃进, 等. 种子败育型无核葡萄胚挽救研究[J]. 北方园艺, 2012(7): 1-5.

[9] 徐海英, 阎爱玲, 张国军. 葡萄二倍体与四倍体品种间杂交胚珠的离体培养[J]. 果树学报, 2001, 18(6): 317-320.

[10] POMMER C V, RAMMING D W, EMERSHAD R L. Influence of grape genotype, ripening season, seed trace size, and culture date on in ovule embryo development and plant formation[J]. Bragantia, 1995, 54(2): 237-249.

[11] GARCIA E, MARTINEZ A, GARCIA DE LA CALERA E, et al. In vitro culture of ovules and embryos of grape for the obtention of new seedless table grape cultivars[C]//VII International Symposium on Grapevine Genetics and Breeding 528. 1998, 663-666.

[12] 肖丽珍. 设施栽培无核葡萄胚珠、胚发育动态[J]. 中国林副特产, 2012(4): 6-8.

[13] 杜万涛, 郭印山, 王英. 三倍体葡萄胚挽救技术研究[J]. 北方果树, 2012(2): 4-7.

[14] 王飞, 王跃进, 周会玲, 等. 无核葡萄与中国野生葡萄杂种胚发育和败育的细胞学研究[J]. 西北农林科技大学学报, 2005, 33(3): 61-65.

[15] 刘佳, 刘晓, 陈建, 等. 金星无核葡萄胚挽救影响因素的研究[J]. 西南农业学报, 2013, 26(1): 294-298.

[16] 郭印山, 郭修武, 张海娥, 等. 利用胚挽救技术获得三倍体葡萄植株研究[J]. 沈阳农业大学学报, 2005, 36(5): 606-608.

[17] 牛茹萱, 张剑侠, 王跃进, 等. 种子败育型无核葡萄胚挽救研究[J]. 北方园艺, 2012(7): 1-5.

[18] 王跃进, 张剑侠, 李桂荣. 采用胚挽救技术获得抗病无核葡萄新材料的研究[J]. 甘肃农业大学学报, 2001, 36(9): 105-110.

[19] GALBRAITH D W, HARKINS K R, MADDOX J M, et al. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues[J]. Science, 1983, 220(4601): 1049-1051.

[20] 郭修武, 郭印山, 张海娥, 等. 接种时期和培养基对无核葡萄胚挽救的影响[J]. 园艺学报, 2007, 34(2): 329-332.

The studies on embryo rescue techniques of seedless grape selfing

TIAN Shufen1, WEN Xiaomin1,2, ZHANG Na1, YUE Ya1,2, LU Fengzhen1,2
（1. Tianjin Facility Agriculture Research Institute/Tianjin Enterprise Key Laboratory of Grape Genetics and Breeding, Tianjin 300192; 2. College of Life Science, Tianjin Normal University, Tianjin 300387）

Grape selfing ovules from of Otilia, Ruby Seedless, Himrod Seedless, and Centennial Seedless were used as materials. These ovules were cultured by embryo rescue. Factors including parents selection, sampling dates, development temperature were studied. The main results were as follows, parents selection had great influence on embryo rescue. Embryo development and germination rate from high to low was Otilia selfing, Ruby Seedless selfing, Himrod Seedless selfing, Centennial Seedless selfing. The optimal sampling dates varied among different varieties, the optimal sampling date were 54 days after bloom (DAB) in Otilia and Himrod Seedless selfing, 61 days(DAB) in Ruby Seedless, respectively. Percentages of embryo development in Otilia selfing and Ruby Seedless selfing were higher when embryos were cultured in 25℃. Low temperature would inhibit embryo development.

seedless grape; self-crossing; embryo rescue

S663.1

：A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.04.004

2017-06-10

天津市科技计划项目（16ZXZYNC00160），天津市农业科学院院长基金（15010）。

田淑芬（1966-），女，研究员，博士，主要从事葡萄栽培与选育种方面的研究。E-mail: tianshufen@263.net