混合酶酶解法对天龙粉水提液抗肿瘤作用影响的研究

朱明珠，王 颖，张由芹，王彦多，王集会

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学实验中心，山东 济南 250355 )

混合酶酶解法对天龙粉水提液抗肿瘤作用影响的研究

朱明珠1，王 颖1，张由芹1，王彦多1，王集会2*

(1.山东中医药大学药学院，山东济南250355；2.山东中医药大学实验中心，山东济南250355 )

目的： 比较天龙粉水提液经混合酶酶解前后对喉癌hep2细胞株的抑制作用。方法： 使用MTT法，以细胞抑制率为指标，研究天龙粉水提液经胰蛋白酶和弹性蛋白酶作用前后对喉癌hep2细胞株的抑制作用。结果： 在所选药物浓度范围内，天龙粉水提液对喉癌hep2细胞株无抑制作用，一定浓度的天龙粉酶解液对喉癌hep2细胞株有抑制作用。结论： 天龙粉水提液经胰蛋白酶和弹性蛋白酶酶解后在一定药物浓度下产生抑制喉癌hep2细胞株生长的作用。

天龙粉；MTT法；喉癌hep2细胞株；混合酶

中药天龙又名守宫、壁虎，为壁虎科动物无蹼壁虎等的干燥全体，其用于肿瘤的治疗已有数百年的历史[1]。研究表明，天龙对多种恶性肿瘤的治疗有确切的疗效[2]，比如肝癌[3]、人食管鳞癌细胞EC9706[4]等。有相关研究报道，壁虎的醇提物可以诱导人喉癌hep2细胞的凋亡[5]，说明壁虎中可能存在抑制人喉癌hep2细胞株生长的有效成分。有研究发现，某些动物类中药经酶解后可以释放出活性多肽和其它活性的小分子物质[6]，可以更好地发挥药理作用。

本实验以天龙粉水提液为初始药液，使用胰蛋白酶和弹性蛋白酶混合酶酶解天龙粉水提液制备天龙粉酶解液，使用MTT分析法，以细胞抑制率为指标，从而比较天龙粉水提液经混合酶酶解前后对喉癌hep2细胞株的作用。

1 实验材料

1.1 药材

天龙购自安徽亳州，天龙粉由山东中医药大学实验中心化学实验室自制。

1.2 主要仪器

立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50FBS)；FA-1004N型电子分析天平(上海精密仪器有限公司)；KQ-500E 型超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司)；倒置显微镜(XDS-1B)；PHS-25型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)等。

1.3 试剂

胰蛋白酶;弹性蛋白酶；注射用顺铂(齐鲁制有限公司);蒸馏水等。

1.4 实验细胞

喉癌hep2细胞株由山东省立医院提供。

2 实验方法

2.1 天龙粉水提液的制备

精密称取天龙粉两份，每份1.0000g，以料液比1:30加入定量的蒸馏水，进行超声提取30min，抽滤、离心，取其中一份水提液，置100 mL锥形瓶中，使用氢氧化钠溶液调pH值=8，置37 ℃恒温水温箱中搅拌放置4 h，得天龙粉水提液。

2.2 天龙粉酶解液的制备

取2.1中另一份水提液，置100 mL锥形瓶中，使用氢氧化钠溶液调pH值=8，弹性蛋白酶0.0667 g，加入胰蛋白酶0.04 g，置37 ℃恒温水温箱中进行搅拌酶解4 h，得天龙粉酶解液。

表1 2种蛋白酶的水解条件

2.3 MTT分析法

2.3.1 细胞复苏

从超低温冰箱取出冻存的肿瘤细胞，将其立即投入到37 ℃灭菌水中，等待液体溶化后，将其以2000 r/min的速度离心3 min，收集细胞，放置在5 % CO2、37 ℃的培养箱中用含10 %胎牛血清的1640新鲜培养基进行细胞培养。

2.3.2 接种

用0.25 %的胰酶细胞消化液(含0.02 %EDTA)对生长至80 %融合的肿瘤细胞进行消化，将对数生长期的肿瘤细胞以100 μL孔进行接种于96孔板中，而预留下3个调零孔不加肿瘤细胞，只加不含血清的1640培养基。

2.3.3 加药

使用10 mL的1640培养液溶解精密称取的10 mg冻干粉，配成药物浓度为1 mg/mL的初始药液，使用0.22 um的滤膜过滤、滤过液依次稀释配成1、0.5、0.25 mg/mL的药物浓度，等待细胞长满单层后，弃去培养基，调零组、空白对照组加入100 μL不含血清的1640培养基，阳性对照组加入100 ul的100 μg/mL的顺铂，其他组每孔分别加入100 μL含不同药物浓度的1640 培养基,每个浓度药物分别加5个孔，使其在37 ℃、5 %CO2的培养箱中培养24 h。

2.3.4 测定细胞抑制率

每孔加20 uL的5 mg/mL MTT溶液,将其避光放置4 h,除去上清液，加入100 uL的DMSO，用酶标仪在492 nm下进行测定OD值,从而计算细胞抑制率，计算公式如下。

3 结果

实验测得药物对喉癌hep2细胞株的抑制率如表2所示。

表2 天龙粉水提液经混合酶酶解前后对喉癌hep2细胞株的抑制率

4 讨论

由表2可知，在所选的药物浓度下，天龙粉水提液对喉癌hep2细胞株无抑制作用，天龙粉混合酶酶解液在较低的药物浓度下对喉癌hep2细胞株无抑制作用，在较高的药物浓度下，对喉癌hep2细胞株有一定的抑制作用。原因可能是因为天龙粉水提液经混合酶酶解后，相应的氨基酸之间的肽键发生断裂，使蛋白质分子发生水解，进而可以释放出活性多肽以及其它活性小分子物质，这些物质可能是抑制喉癌hep2细胞株生长的有效成分，在较低的药物浓度下，活性多肽及活性小分子物质的含量比较低，因此，发挥药理作用比较弱，表现不出抑制喉癌hep2细胞株生长的作用，而当药物浓度升高后，相应的活性多肽和小分子物质的含量会随之增加，当药物浓度达到一定程度时，进而表现出抑制喉癌hep2细胞株生长的作用。

由于酶具有专一性，只能水解特定氨基酸之间形成的肽键，而混合酶相对于单一酶来讲，其可以使肽键较多地被水解，因此，可以使蛋白质水解成更小分子的活性肽类及其它活性小分子物质，研究表明，动物类药材发挥作用的主要有效成分为活性小分子肽类[6-7]，因此，混合酶酶解法作为一种生物技术运用在动物药活性成分的提取中有较大意义，对于新药的研发也有一定的意义，本实验研究对后期天龙粉抗肿瘤的研究具有一定参考价值。

(本研究在山东中医药大学国家级实验教学示范中心平台完成，特此感谢)

[1] 崔朝初. 壁虎醇提物(Ⅱ)的抗肿瘤作用研究[D]. 洛阳:河南科技大学,2013.

[2] 韩进庭. 壁虎的抗肿瘤药理作用与临床应用研究进展[J].现代医药卫生,2011(13):2019-2020.

[3] 谢 斌. 无蹼壁虎抗肿瘤活性成分对人肝癌HepG2细胞作用的实验研究[D].潍坊：潍坊医学院,2012.

[4] 王晓兰,王淑英,王建刚. 壁虎醇提物对人食管鳞癌细胞EC9706的作用和体内抗肿瘤活性[J]. 中国中药杂志,2010(16):2175-2179.

[5] 崔朝初,王建刚,段冷昕,等. 壁虎醇提物诱导人喉癌细胞Hep2凋亡的实验研究[J]. 天然产物研究与开发,2013(04):551-554.

[6] 王爱华,柳美玲,戴志明,等.小肽的吸收机制与营养价值研究进展[J].上海畜牧兽医通讯,2008(2):7.

[7] 王克夷.开发小肽，筛选新药[J].中国生化药物杂志，2003，24(1)：48.

(本文文献格式：朱明珠，王颖，张由芹，等.混合酶酶解法对天龙粉水提液抗肿瘤作用影响的研究[J].山东化工，2017，46(16)：11-12.)

Study on Anti-tumor Effect of Mixed Enzyme Enzymolysis for Water Extraction Liquid from Gecko Powder

Zhu Mingzhu1,Wang Ying1,Zhang Youqin1,Wang Yanduo1,Wang Jihui2*

(1. The Pharmacy College , Shandong Univerity of Traditional Chinese Medicine,jinan 250355,China;2.The Experiment Center ,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,jinan 250355,China)

Objective :To compare water extract from Gecko powder by mixed enzyme enzymolysis before and after have inhibition effect on laryngeal cancer cell hep2 line.Methods :Using MTT method,the inhibition rate on cells as indicator,comparing the inhibitory effect on laryngeal cancer cell hep2 line for water extract from Gecko powder by trypsin and elastase function before and after.Results:Within the scope of the selected drug concentration, water extract from Gecko powder laryngeal haven't inhibition on laryngeal cancer cell hep2 line, enzymolysis water extract from Gecko powder in certain concentration have inhibition on laryngeal cancer cell hep2 line.Conclusion: Water extract from Gecko powder in certain concentration produce inhibition on laryngeal cancer cell hep2 line by trypsin and elastase function.

gecko powder；MTT method; laryngeal cancer cell hep2 line；mixed enzyme

R285.5

：A

：1008-021X(2017)16-0011-02

2017-06-02

山东中医药大学大学生研究训练(SRT)计划资助项目(项目编号2016031)

朱明珠(1996—)，女，山东曲阜人，本科在读，研究方向：制药工程；通信作者：王集会(1962—)，副教授，研究方向：虫类中药发酵及活性成分研究。