发酵天龙粉中总多糖的含量测定方法研究

张由芹，王 颖，朱明珠，王集会

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学实验中心，山东 济南 250355 )

发酵天龙粉中总多糖的含量测定方法研究

张由芹1，王 颖1，朱明珠1，王集会2

(1.山东中医药大学药学院，山东济南250355；2.山东中医药大学实验中心，山东济南250355 )

[目的] ：创建发酵天龙粉中多糖含量测定方法。[方法]：发酵天龙粉中的多糖的提取采用超声水提取的方法，发酵天龙粉多糖的含量的测定采用紫外分光光度法。[结果] ： 测得发酵天龙粉中多糖含量为13.4628 mg/g，相对标准误差(RSD)为4.19%(n=5)[结论]： 发酵天龙粉多糖的含量的测定采用紫外分光光度法，不仅操作简单，而且准确度高，可用来测定天龙粉中多糖的含量。

发酵天龙粉；总多糖；含量测定；超声水提取法；紫外分光光度法

壁虎科蹼趾壁虎(Gekko Chinensis Groy),或同属它科壁虎的干燥体，亦名守宫、天龙，广东地区又称其为"盐蛇"。江、浙、皖等省均有产。味咸，性寒，有小毒。入心、肝二经[1]。具有祛风定惊、止咳平喘、解毒散结、通络止痛等功效，临床常用于非小细胞肺癌、肝癌、胃肠道癌等恶性肿瘤的治疗，疗效确切[2]。多糖(polysaccharides,PS)是由10个以上的单糖聚合而成的生物高分子，多糖包含均多糖(homosaccharide)和杂多糖(heterosaccharide),前者是由同一单糖组成，后者则是两种以上不同的单糖组成[3]。近年来，针对中药多糖的药理活性研究成为热点，已经证实中药多糖具有促进免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗应激、抗辐射及抗衰老等多种生物活性，对促进机体特异性免疫与非特异性免疫都有广泛的影响[4]。糖的定量、定性测定是糖研究的一个重要基础工作[5]。目前，国内植物多糖的提取较多，对于虫类中多糖的提取和含量的测定的报道较少，为此，笔者通过超声水提取的方法进行提取，紫外分光光度计法测定其含量，效率较高，成本低，这为今后虫类中总多糖的研究具有一定的意义。

1 实验仪器与材料

1.1 仪器

FA1004N型电子分析天平(上海精密仪器有限公司)；LDZ4-0.8型离心机(北京医用离心机厂)；HH-6数显恒温水浴锅(上海梅香仪器有限公司)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UV9100B型可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)。

1.2 试剂

吐温-80、化学对照品芦丁( 中国医药上海化学试剂公司)、苯酚、浓硫酸、 D-无水葡萄糖为分析纯，所用水为重蒸水。

1.3 药材

天龙购自安徽亳州，经山东中医药大学生药系高德民老师鉴定为无蹼壁虎Gekko swinhonis Gunther。发酵天龙粉，批号20150801，由山东中医药大学实验中心化学实验室自制。白僵菌孢子粉(100亿/g,山东省农业科学院植物保护研究所自筛菌株——桃5)。

2 方法与结果

2.1 发酵天龙粉的制备

称取(精确称量)定量干燥的天龙粉，然后取1.00 g白僵菌孢子粉，加入少量定量的吐温-80，用灭菌水稀释成为每毫升含1×108个孢子的混悬液，取其适量，然后拌匀润湿，在25～28 ℃，湿度为95 %的条件下，恒温恒湿培养箱中发酵8天左右，待长满菌丝后停止发酵。

2.2 发酵天龙粉中总多糖供试品溶液的制备

取发酵天龙粉约0.5 g，精密称定，置于50 mL烧杯中，按料液比1:30加入15 mL蒸馏水，超声提取10 min,抽滤，保留残渣，共浸提三次。将抽滤后的上清液合并，定容至50 mL，即为测总多糖的供试品溶液。

2.3 总多糖含量的测定

2.3.1 标准葡萄糖溶液的制备

精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品10.00 mg，放置在烧杯中，加适量水溶解，然后转移至100 mL容量瓶中，加水至刻度线，摇匀，即得浓度为0.1 mg/mL葡萄糖溶液。

2.3.2 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0,1,1.5,2,2.5,3 mL分别置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度线，分别量取2 mL置15 mL具塞试管中，然后再精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5mL，充分摇匀，放置1 0min，然后置于40℃水浴中保温15 min，取出,冷却至室温。摇匀后，在490 nm波长处测定各样品吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到的线性回归方程为：Y=15.06X+0.004,r=0.9990，范围为 0～0.03 mg/mL 。

2.3.3 精密度试验

精确吸取已制备好的测总多糖的样品液2 mL于 10mL容量瓶中，定容，重复取样5次，每次2 mL，用紫外可见分光光度法在波长 510 nm下连续5次测定吸光值，吸光度分别为0.4268 、0.4292 、0.4286、0.4282、0.4297，相对标准误差RSD=0.26%(n=5)，结果表明该方法精密度良好。

2.3.4 稳定性试验

精确吸取已制备好的测总多糖的样品液2 mL于10 mL容量瓶中，定容， 每次取稀释好的的试样液2 mL，用紫外分光光度计测定其在2、4、6、8、10 h的吸光值，吸光度分别为0.4192 、0.3893 、0.4178 、0.3835 和0.3892结果在10 h多糖含量的相对标准误差RSD=4.31%(n=5)，结果表明该方法稳定性较好。

2.3.5 重复性试验

准确称取发酵天龙粉样品5份,每份约0.5 g，按“2.3.2”项下方法进行提取和制备溶液,重复测定5次，分别用紫外可见分光光度测定吸光值。吸光度分别为0.4064、0.4297、0.4285、0.4028和0.4282，相对标准误差RSD=3.16%(n=5)，结果表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验

准确称取已测知总多糖含量的发酵天龙粉样品5份,每份约0.5 g,各加入8.00 mg的芦丁标准对照品,按“2.3.2”项下方法进行提取和制备溶液, 分别用紫外可见分光光度测定吸光值，并计算加样回收率。结果平均回收率为98.95% ，相对标准误差RSD=2.33%。结果表明该方法符合回收率在95%～105%的要求。

2.3.7 样品测定

精密量取已经制备好的测总多糖的样品液2 mL于 10mL容量瓶中，定容后，量取2mL置于具塞试管中，按照“2.3.2”项下方法在490 nm 处测定吸光度，通过回归方程计算总多糖的浓度，然后总多糖的含量，结果见表1。

3 讨论

(1)多糖为天然产物，来源广泛，具有毒副作用小、无残留、不产生耐药性等优点，因而备受研究者重视[4]。多糖广泛存在于自然界中，是多种中药的有效成分之一，而且具有很多生物活性, 多糖类药物的研制已成为当今世界新药的发展方向之一[6]。发酵天龙粉中多糖的含量明显高于未发酵天龙中多糖的含量[7]，具有较高的开发利用价值。本实验采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量，实验过程中，影响紫外吸收的因素有很多，待测物质有混悬颗粒、待测溶液中有干扰的吸收物质等，需要排除影响因素。采用分光光度法测定多糖的含量精密度、稳定性以及重现性都符合实验要求，可以用来测定发酵天龙粉中总多糖的含量。

表1 发酵天龙粉中总多糖的含量

(2)将中药天龙粉作为固体培养基，球孢白僵菌作为发酵药用真菌，采用固体发酵炮制方法所产生的发酵天龙粉，是传统中药炮制技术与现代生物技术的完美结合。对虫类中的原有物质进行结构修饰和改造，增强其攻毒散结的作用。但是虫类中药的发酵炮制制药目前的研究报道并不多见，应该引起人们的足够重视[8]。天龙的治疗疾病作用显著，其中所含有的多糖成分又是其中发挥作用的重要组成部分，因此对总多糖对其提取以及含量的测定具有积极的作用，对于临床用药具有一定的促进作用。

[1] 朱良春. 虫类药的临床应用——守宫[J]. 江苏医药, 1977(8) ：20-22.

[2] 刘玉军,李 刚,马 睿,等.天龙抗肿瘤研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2011, 17(7):262-264.

[3] 徐晓飞,陈 健.多糖含量测定的研究进展[J].食品科学, 2009, 30(21):443-448.

[4] 郭浩杰, 杨严格,安 乐,等. 中药多糖的分子修饰及其药理活性研究进展[J]. 中草药, 2015, 46(7):1074-1080.

[5] 李计萍. 中药新药研究中多糖含量测定方法探讨[J].中国中药杂志,2014(17):3392-3394.

[6] 田庚元,冯宇澄,林颖. 植物多糖的研究进展[J].中国中药杂志, 1995 , 20 (7) :441-444.

[7] 王 颖,马明珠,王立娜,等. 发酵前后天龙粉水溶性活性物质含量对比研究[J]. 湖南中医杂志,2016(09):166-168.

[8] 王 颖,王立娜,刘春雨,等. 发酵天龙粉中总黄酮含量测定方法研究[J]. 山东化工,2017,46(02):64-65,67.

(本文文献格式：张由芹，王颖，朱明珠，等.发酵天龙粉中总多糖的含量测定方法研究[J].山东化工，2017，46(16)：87，94.)

Study on the Determination Method of Total Polysaccharides Content in the Fermented Gekko Powders

Zhang Youqin1, Wang Ying1,Zhu Mingzhu1, Wang Jihui2

(1. The pharmacy college , Shandong University of Traditional Chinese Medicine,jinan 250355,China;2.The experiment center ,Shandong University of Traditional Chinese Medicine ,Jinan 250355,China)

Objective: To establish the method for determining the contents of total polysaccharides in the ferrmented Gekko Powders. Methods: Total polysaccharides in the ferrmented Gekko Powders were extracted by ultrasonic water extraction. UV-VIS spectrophotometry was adopted to determine the content of total polysaccharides.Results:The polysaccharides contents of the fermented Gekko powders was 13.4628mg/g,RSD was 4.19%(n=5).Conclusion: The determination of total polysaccharides in the ferrmented Gekko Powders use the UV-VIS spectrophotometry , the method is simple and accurate. So the method can be used to determine the content of total polysaccharides in the ferrmented Gekko Powders.

fermentation of Gekko powders; total polysaccharides; content determination;ultrasonic water extraction;UV-VIS spectrophotometry

R284

：A

：1008-021X(2017)16-0087-01

2017-06-01

山东中医大学大学生研究训练(SRT)计划资助项目(项目编号：2016055)

张由芹(1995—)，女，山东沂水人，本科在读，研究方向：制药工程;通讯作者：王集会(1962—)，副教授，研究方向：虫类中药发酵及活性成分研究。