调控CD163基因表达的miRNA鉴定及其在PRRSV感染中的作用分析

吴俊静+乔木+武华玉+彭先文+梅书棋

摘要：猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染引起的一种危害大、控制难的猪传染性疾病。PRRSV必须通过特异性受体诱导才能入侵宿主细胞，而CD163就是其中一个关键受体。在获得靶向作用CD163基因miRNA的基础上，进一步研究发现过表达miR-181c、miR-4262可极显著抑制细胞内[WTBX][STBX]CD163mRNA的表达（P<0.01）；且在Marc-145细胞中证实miR-181c、miR-23b、miR-4262均具有极显著抑制PRRSV增殖的功能（P<0.01），其中miR-4262抑制效果最佳。3个miRNA抗PRRSV增殖的分子机制比较复杂，miR-181c、miR-4262 可通过靶向抑制受体[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]发挥抗PRRSV增殖作用，而miR-23b是通过其他途径发挥作用。并首次发现miR-4262具有抑制PRRSV增殖的作用，但其具体的分子作用机制还有待进一步深入研究。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）；[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因；miRNA；抗病

中图分类号： S858.285.3文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0016-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-03-18

基金项目：国家自然科学基金（编号：31501924）；湖北省自然科学基金（编号：2015CFA105）；湖北省技术创新重大项目（编号：2016ABA117）；湖北省科技支撑计划（编号：2014BBB010）；湖北省农业科技创新中心创新团队项目（编号：2016-620-000-001-022）；湖北省农业科学院竞争性计划项目（编号：2016jzxjh029）。

作者简介：吴俊静（1984—），女，湖北武汉人，博士，助理研究员，主要从事猪遗传育种研究。Tel：（027）87389516；E-mail：jeanne1106@126.com。

通信作者：梅书棋，硕士，研究员，主要从事猪遗传育种研究。E-mail：msqlfe@163.com。

[ZK）]

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染引起的一种危害极大的传染性免疫抑制性疾病，以妊娠母猪的繁殖障碍（流产、死胎、木乃伊胎）及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征。1987年猪繁殖与呼吸综合征首次在美国暴发，几年之内PRRS便席卷了北美洲、欧洲、亚太地区，至今仍在世界范围内流行。特别是近年来由高致病性PRRSV引起的突发疫情高热病在我国很多省份暴发和流行，仔猪致死率高，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[1]。由于PRRSV具有变异快且复杂、免疫抑制、存在抗体依赖性增强作用等特征，目前采用疫苗等手段未能取得满意的效果，防治PRRS仍然是养猪业的重大难题之一。

PRRSV有一个典型的生物学特征就是具有严格的宿主和细胞嗜性，它只感染猪，不感染其他物种，且主要感染单核巨噬细胞系中分化完全的细胞，尤其是猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAM）。在体外，PRRSV可在PAM和猴肾细胞系及其衍生细胞系（Marc-145、MA-104等）中增殖。宿主细胞膜上的一些特异性受体的存在与否决定了该细胞对PRRSV的易感性，而[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]就是PRRSV感染宿主细胞的最关键受体之一，它参与介导病毒的内吞和增殖[2]。例如，在PRRSV非易感细胞系（BHK-21、PK-15、NLFK）中转染[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]真核表达质粒可以使这些细胞系感染PRRSV并在细胞内产生子代病毒粒子[3-4]。采用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的抗体处理PAM可以有效阻止PRRSV的感染[3]，且永生化的PAM細胞系因无法正常表达[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]而变为PRRSV非易感细胞[5]。不仅如此，[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的表达量与PRRSV复制效率呈正相关，上调[WTBX][STBX]CD163表达会增加病毒增殖，而下调CD163[WTBZ][STBZ]表达可降低病毒增殖[6]。

MicroRNA（miRNA）是一类长约22个碱基、高度保守的内源性非编码RNA分子，能够互补或部分互补地与靶mRNA结合，使mRNA降解或介导其翻译抑制，作为重要的转录后调节因子调控基因的表达[7]，miRNA几乎参与调控了各个领域的所有细胞生命活动的发生，在哺乳动物中可能负责调控约50%的编码基因[8]。在病毒感染和宿主天然免疫中，miRNA 也发挥着重要作用，参与病毒与宿主的互作，一方面，宿主miRNA可以作用于病毒基因组RNA抑制病毒增殖[5，9]，另一方面，病毒释放的miRNA可作用于宿主基因抑制天然免疫[10-11]。

在前期工作中，笔者利用双荧光素酶报告系统筛选获得了3个可靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因3′非翻译区的miRNA，分别为 miR-181、miR-23、miR-4262[12]，本研究将进一步分析其对[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因表达调控效应及对PRRSV感染增殖的抑制效果，为进一步获得抗PRRSV增殖的功能miRNA奠定基础。

1材料与方法

[HTK]1.1细胞和病毒[HT]

Marc-145细胞系，来源于华中农业大学，用含10%胎牛血清的DMEM培养基（购自HyClone）于5% CO2、37 ℃培养箱中培养。PRRSV-WUH3毒株，由华中农业大学分离保存，用于细胞感染试验。endprint

1.2miRNA模拟物和抑制物

miRNA模拟物由上海吉玛制药技术有限公司人工合成，其序列如表1所示。

1.3miRNA模拟物转染和PRRSV感染

转染24 h前，消化Marc-145细胞，并通过细胞计数板对细胞悬浮液进行计数，以1×105个/孔细胞进行均匀地铺板，细胞长满80%的计数板时开始转染。各miRNA模拟物按一定浓度（20、50、60、100 nmol/L）稀释后与脂质体Lipofectamine 2000（购自Invitrogen）共孵育制备混合液，将混合液加入细胞培养基中，然后在5% CO2、37 ℃条件下培养24 h后收集细胞或细胞上清液，进行病毒感染。同时设置各种对照，Mock组为转染空白对照组，仅加入了转染试剂处理细胞，为转染miRNA模拟物；NC组为miR-NC模拟物阴性对照组；NTC组为病毒感染空白对照组，采用PBS处理细胞。

1.4PRRSV感染

接种病毒前，先将病毒原液置于冰上慢慢融化。Marc-145转染24 h后，用PRRSV-WUH3感染细胞[感染复数（multiplicity of infection，MOI）为0.1]，感染24 h后收集细胞或细胞上清液。

1.5RNA提取及RT-PCR

细胞或细胞培养液总RNA采用Trizol（购自Invitrogen）提取。反转录采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（购自Thermo Scientific），荧光定量PCR采用SYBR Select Master Mix for CFX（购自Applied Biosystems）染料，相对定量PCR采用GAPDH基因做内参。病毒RNA的绝对定量，采用含有PRRSV病毒基因组片段（138 bp）的pMD-18T载体（购自TaKaRa）作为标准品制作标准曲线。每个试验至少重复3次。定量PCR所用引物的详细信息如表2所示。

1.6统计分析

[JP2]数据用“平均值±标准差”表示；采用Students t检测统计数据，P<0.05、P<0.01分别表示差异达到显著、极显著水平。[JP]

2结果与分析

2.1调控[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA表达的miRNA验证

在前期研究中发现miR-181、miR-23、miR-4262均可靶向与[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因的3′非翻译区结合[12]，为了验证这3个miRNA是否能调控[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因 mRNA表达，本研究通过转染miR-181c、miR-23b、miR-4262的模拟物在细胞内过表达各miRNA，检测[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA表达量的变化情况，进一步验证候选miRNA对[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的靶向调控作用。由图1可知，与转染空白对照组相比，转染不同浓度梯度（20、50、100 nmol/L）的miR-181c、miR-4262均可極显著抑制[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ][JP2]基因 mRNA表达量（P<0.01），而只有转染高浓度剂量（100 nmol/L）的miR-23b才能显著抑制[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因的表达（P<0.05）。转染各浓度梯度的阴性对照miR-NC组的[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因 mRNA表达水平与空白对照Mock组无显著差异（P>0.05）。可见miR-181、miR-4262均可靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因抑制其mRNA表达，且miR-4262的抑制效果最佳。[JP][FL）]

[FK（W12][TPWJJ1.tif][FK）]

[FL（2K2]2.2miRNA抑制病毒增殖的效应检测

[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]是PRRSV感染宿主细胞的关键受体，而miR-181、miR-4262又可在一定程度上抑制[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因表达，因此，进一步在Marc-145细胞中检测了miRNA抑制病毒增殖的效应。细胞转染60 nmol/L的各miRNA模拟物24 h后，再用PRRSV感染（MOI=0.1），感染24 h后分别检测细胞内和细胞培养液中PRRSV RNA的含量。由图2、图3可知，与转染阴性对照NC组相比，转染miR-181c、miR-23b、miR-4262均能极显著地抑制细胞内和细胞培养液中的PRRSV RNA含量（P<0.01），其中miR-4262的抑制效果最好，可使细胞内病毒含量下降87%。

3讨论与结论

研究表明，miRNA在病毒与宿主的互作中扮演着重要的

[FK（W11][TPWJJ2.tif][FK）]

[FK（W11][TPWJJ3.tif][FK）]

角色，它们可以靶向作用病毒入侵的细胞关键因子[13-14]，或是直接作用于病毒基因组[15-16]。鉴于PRRSV入侵靶细胞必须依赖宿主细胞的特异性受体表达这一典型生物学特性，从[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]这个关键受体入手，筛选鉴定获得调控[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因表达的miRNA，从而找到抑制PRRSV感染增殖的功能miRNA。在前期的研究工作中，通过生物信息学预测和双荧光素酶报告系统发现miR-181c、miR-23b、miR-4262均可靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因[12]，本研究进一步证实miR-181c、miR-23b、miR-4262均可显著抑制PRRSV在细胞中复制增殖，但是这3个miRNA抗PRRSV增殖的分子机制可能不完全相同。endprint

2013年，Guo等首次發现miR-181可以直接作用于PRRSV基因组RNA，使病毒基因组降解发挥抗病毒效应[17]。同年，Gao等研究发现miR-181可以靶向作用受体基因[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的3′UTR，抑制受体基因[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的表达，从而阻止PRRSV增殖[18]，本研究结果与之相符。但是，值得关注的一个问题是本研究发现miR-4262、miR-181c对[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA水平抑制效果相当（图1），但是miR-4262对细胞内和细胞液中释放的病毒含量的抑制效果却显著高于miR-181c（P<0.05），这暗示着这2个miRNA抑制PRRSV的分子机制并不完全相同。通过生物信息学预测分析发现，miR-4262 除了可靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因外，还能靶向调控另外一个PRRSV的关键受体基因[WTBX][STBX]CD169[WTBZ][STBZ]。miR-4262可能可以同时靶向作用[WTBX][STBX]CD163、CD169[WTBZ][STBZ]这2个PRRSV的关键受体基因，进而提高了阻断PRRSV增殖的能力；另外一个原因可能是 miR-4262还参与调节天然免疫信号通路，促进Ⅰ型干扰素的表达，从而提高抗病毒增殖效应。在细胞中转染 60 nmol/L 的miR-4262，同时用 5 μg/mL Poly（I ∶[KG-*3]C）（聚肌苷酸胞苷酸，购自InvivoGen公司）处理，15 h后用MOI=0.1剂量的PRRSV感染24 h，发现与转染miR-NC对照组相比，过表达miR-4262可显著上调Ⅰ型干扰素IFN-α、IFN-β的表达，说明miR-4262可一定程度解除PRRSV对Ⅰ型干扰素的抑制，然而具体分子机制还有待进一步深入研究。

转染低浓度剂量（20、50 nmol/L）的miR-23b并不显著抑制[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA的表达，即使是转染100 nmol/L剂量的miR-23b也只能抑制11%的[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA表达量（图1），然而miR-23b却能大幅度抑制PRRSV在细胞内的复制与病毒的释放（图2、图3）。因此，miR-23b的抗PRRSV增殖效应并不是通过抑制受体[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因实现的。Zhang等研究发现，PRRSV基因组RNA中含有miR-23b的作用靶点，表明miR-23b可能与PRRSV RNA靶向结合抑制病毒增殖[19]。同时，Zhang等还发现PRRSV感染后，miR-23 能通过激活IRF3/IRF7诱导产生Ⅰ型干扰素，进一步抑制病毒感染[19]。

PRRSV具有严格的细胞嗜性，入侵靶细胞依赖宿主细胞上特异性受体的表达，而[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]就是PRRSV入侵的一个关键受体基因。在获得靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因的miRNA的基础上，进一步在细胞水平证实了miR-181c、miR-23b、miR-4262具有抑制PRRSV增殖的效应，其中miR-4262抑制效果最佳。3个miRNA抑制PRRSV增殖的分子机制不尽相同。miR-181c是同时通过靶向作用PRRSV基因组RNA和抑制PRRSV关键受体[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]发挥抗病毒作用；miR-4262是通过靶向抑制PRRSV关键受体[WTBX][STBX]CD163和CD169[WTBZ][STBZ]，同时参与诱导产生Ⅰ型干扰素抑制病毒增殖；miR-23b则可能是直接通过激活IRF3/IRF7诱导产生Ⅰ型干扰素抑制病毒感染。本研究首次发现miR-4262具有抑制PRRSV增殖的作用，其具体分子作用机制还有待更进一步的深入研究。

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