几种中药提取物对二斑叶螨的生物活性及其对主要解毒代谢酶活性的影响

宋珊珊, 王 辉, 王章训, 王新谱

(宁夏大学农学院, 银川 750021)

几种中药提取物对二斑叶螨的生物活性及其对主要解毒代谢酶活性的影响

宋珊珊, 王 辉, 王章训, 王新谱*

(宁夏大学农学院, 银川 750021)

用3种不同有机溶剂对蛇床子Cnidiummonnieri、白头翁Pulsatillachinensis、百部Stemonajaponica、半夏Pinelliaternata、紫丁香Syringaoblate进行了提取,获得15种植物粗提物,并采用玻片浸渍法对二斑叶螨进行室内药效测定。结果表明,当各粗提物浓度为5.00 mg/mL时,蛇床子丙酮提取物A-SCZ和蛇床子氯仿提取物C-SCZ在处理24 h后,二斑叶螨的校正死亡率为100%,具较好的杀螨活性。室内毒力试验表明,A-SCZ、C-SCZ、百部乙醇提取物E-BB、白头翁乙醇提取物E-BTW、白头翁氯仿提取物C-BTW对二斑叶螨的LC50分别为2.68、1.68、4.14、11.91、5.93 mg/mL。测定施药后4 h和24 h二斑叶螨体内乙酰胆碱酯酶(AchE)、羧酸酯酶(CarE)、酸性磷酸酯酶(ACP)、碱性磷酸酯酶(ALP)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)、多功能氧化酶(MFOs)等解毒代谢酶的活力变化情况,结果表明,白头翁、紫丁香、蛇床子的活性成分主要抑制二斑叶螨体内AchE、GSTs、ACP和CarE而发挥杀螨作用,而百部粗提物主要抑制的是害螨体内GSTs和MFO。A-SCZ、C-SCZ提取率达19.83%和21.62%,表明这两种中药提取物有较高的提取率和杀螨活性,具有很大的开发潜力。

中药提取物; 二斑叶螨; 蛇床子; 白头翁; 百部; 半夏; 紫丁香; 生物活性; 解毒代谢酶

化学农药在防治病虫害方面起到了重要作用,但长期以来,大量的化学农药造成农药残留日益加重,不仅破坏了作物的品质,还影响了农业生态环境,直接危害人体健康。植物源农药因其低毒、低残留的特性而受到市场的迫切需求。从天然产物,尤其是从植物中发现杀虫活性物质,是创制新型无公害农药的重要途径。我国的植物资源丰富,传统中药材在治疗和缓解人类各种疾病中起着非常重要的辅助作用,且其具有获取方式方便、经济、对环境伤害低等优点[1]。因而从中草药中筛出杀虫活性高的活性物质,作为环境友好型农药用于防治害虫,成为植物源农药开发应用的研究热点。前人对从药用植物中提取潜在的杀虫活性物质做了大量的研究工作,豆科、菊科、茄科、唇形科和伞形科植物对害螨具有很好的触杀作用,如苦豆子SophoraalopecuroidesLinn.、川楝MeliatoosendanSieb.etZucc.、丁香草AsmoniaellipticaRoem.etSchull.、青蒿ArtemisiaannuaLinn.、烟草NicotianatabacumLinn.、黄柏PhellodendronchinenseSchneid.、益母草Leonurusartemisia(Lour.)S.Y.Hu、番茄LycopersiconesculentumMill.、瑞香狼毒StellerachamaejasmeLinn.、尾叶鱼藤DerriscaudatilimbaHow和含羞草MimosapudicaLinn.等植物的粗提物都被证明具有较高的杀螨活性[2-10]。已经开发出了印楝素、苦参碱、蛇床子素和烟碱·苦参碱等植物源农药产品[11-15]。

害虫体内的各种解毒代谢酶及其他生化酶在对杀虫剂等的代谢中起重要作用,可以促进害虫对外源有害物质和次生代谢物质的解毒代谢。如酯酶能够水解羧酸酯键和磷酸酯键,尤其是水溶性短链酯类;多功能氧化酶能够通过羟基化、氧化水解等催化各种结构不同的物质氧化[16];谷胱甘肽转移酶在保护组织抵御氧化侵害及氧化压力中起重要作用[17]。

二斑叶螨TetranychusurticaeKoch属蜱螨目,叶螨科,是一种世界性害螨[18]。1983年我国北京地区首次发现二斑叶螨为害花卉作物,现已逐渐成为果树和蔬菜作物的重要害螨之一[19]。二斑叶螨因寄主范围广、繁殖速度快、抗药性强、隐蔽性强,成为世界范围内农业生产上的一个重要问题。其寄主植物非常繁杂广泛,据记载共有50科800余种,可寄生于果树、蔬菜、花卉、田间农作物及农田杂草上[20-22]。

本研究选取蛇床子Cnidiummonnieri(Linn.)Cusson、白头翁Pulsatillachinensis(Bunge.)Regel、百部Stemonajaponica(Blume.) Miq.、半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit、紫丁香SyringaoblataLindl. 5种中药材,用乙醇、丙酮和氯仿3种有机溶剂共获得15种粗提物,进行室内药效试验和毒力测定,以期筛选出对二斑叶螨具有较好生物活性的中药材,为中药材的综合开发利用和研制防治二斑叶螨的植物源杀螨剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

试验所用主要试剂详见表1。

表1试验主要试剂

Table1Mainreagents

试剂名称Reagent纯度Purity生产厂家Manufacturer氢氧化钠99%天津市北联精细化学品开发有限公司磷酸氢二钠99%天津市滨海科迪化学试剂有限公司乙醇95%上海禾颖化工有限公司氯仿分析纯青岛精科仪器试剂有限公司丙酮分析纯上海津力化工有限公司磷酸二氢钠(批号20120308)分析纯天津市致远化学试剂有限公司乙酰胆碱酯酶(AchE)试剂盒-苏州科铭生物技术有限公司羧酸酯酶(CarE)试剂盒-苏州科铭生物技术有限公司酸性磷酸酯酶(ACP)试剂盒-苏州科铭生物技术有限公司碱性磷酸酯酶(ALP)试剂盒-苏州科铭生物技术有限公司谷胱甘肽S⁃转移酶(GSTs)试剂盒-苏州科铭生物技术有限公司蛋白含量测定试剂盒-苏州科铭生物技术有限公司多功能氧化酶(MFO)试剂盒-南京建成生物科技有限公司

1.2 主要仪器

试验所用主要仪器设备详见表2。

表2试验主要仪器

Table2Mainexperimentalinstruments

仪器设备Instrumentandequipment型号Model生产厂家Manufacturer新型高速连续式超微粉碎机CLF⁃30B浙江省新昌县城关红利数控制造厂索式提取器BSXT06上海比朗仪器制造有限公司智能人工气候培养箱RTOP⁃260D浙江托普仪器有限公司水浴摇床TS⁃110X30上海柏欣仪器设备厂电热恒温鼓风干燥箱DHG⁃9420A上海一恒科学仪器有限公司电子天平LE204E/02梅特勒⁃托利多上海仪器有限公司循环水真空泵SHZ⁃Ⅲ上海亚荣生化仪器厂旋转蒸发仪OSB⁃2100EYELA日本东京理化旋转蒸发仪N⁃1100EYELA日本东京理化冰箱BCD⁃575WBDL青岛海尔股份有限公司尼康体视显微镜SMZ745T南京兆坤仪器有限公司多功能荧光酶标仪SP⁃Max3500FL上海闪谱生物科技有限公司制冰机YKKYFM70北京长流科学仪器有限公司

1.3 供试叶螨

供试二斑叶螨于2014年7月采自宁夏银川市玉米田,经鉴定后在室内接种到菜豆上纯化种群,扩大繁殖备用。

1.4 供试材料

试验所用蛇床子、白头翁、百部、半夏中药材均采购自宁夏中医研究院,紫丁香采自宁夏大学校园。其中蛇床子和半夏供试部位是种子,百部和白头翁的供试部位为根部,紫丁香供试部位为枝条表皮。将供试材料于60℃下在DHG-9420A电热鼓风干燥箱中进行30 min干燥处理,之后用CLF-30B超微粉碎机将植物样品粉碎分装后在低温下保存备用。

1.5 试验方法

1.5.1 粗提物的制备

准确称取备用中药材样品100 g,放入2 000 mL烧杯中,加入1 000 mL 95%乙醇溶液,浸泡24 h后,超声提取30 min,抽滤,滤渣再加1 000 mL 95%乙醇超声提取30 min,抽滤,合并两次滤液,用旋转蒸发仪浓缩成浸膏状,将滤渣烘干用以计算提取率,将原液放入4℃冰箱中保存备用。

丙酮和氯仿作为萃取剂的方法同上,试剂均为分析纯。

各溶剂对不同材料的粗提物缩写见表3。

表3各植物粗提物与其缩写对照表

Table3Comparisonofthecrudeextractsandtheirabbreviations

粗提物Crudeextract缩写Abbreviation粗提物Crudeextract缩写Abbreviation乙醇⁃百部粗提物E⁃BB丙酮⁃白头翁粗提物A⁃BTW乙醇⁃蛇床子粗提物E⁃SCZ丙酮⁃半夏粗提物A⁃BX乙醇⁃紫丁香粗提物E⁃ZDX氯仿⁃百部粗提物C⁃BB乙醇⁃白头翁粗提物E⁃BTW氯仿⁃蛇床子粗提物C⁃SCZ乙醇⁃半夏粗提物E⁃BX氯仿⁃紫丁香粗提物C⁃ZDX丙酮⁃百部粗提物A⁃BB氯仿⁃白头翁粗提物C⁃BTW丙酮⁃蛇床子粗提物A⁃SCZ氯仿⁃半夏粗提物C⁃BX丙酮⁃紫丁香粗提物A⁃ZDX

1.5.2 室内药效试验和毒力测定方法

室内药效试验:参照FAO推荐的测定螨类害虫的标准方法—玻片浸渍法(slide-dip method)。方法是将双面胶带剪成载玻片宽度长短(约3 cm),贴在载玻片的一端,揭去胶带上的纸片,用小号勾线笔在豆苗叶片上挑选大小一致,活性较强的成螨,在体视显微镜下将其背部向下贴在双面胶上,各螯肢可以自由活动,每个载玻片上粘两行,每行20头,于培养箱中内放置2 h,用解剖镜观察,严格剔除死亡、不活泼、幼螨及体位不合适的叶螨个体,保留活跃的成螨为测试虫源。试供植物粗提物的浓度为5 mg/mL,以清水处理作对照,所有处理重复3次。将载玻片带虫的一端浸入药液轻轻摇晃,在药液中停留5 s后取出,马上在体视显微镜下用滤纸吸干螨体和周围多余的药液,将载玻片平放入装有湿润棉花的培养皿中,置于温度为(28±1)℃、相对湿度60%、光周期 16L∥8D的培养箱中培养。在浸药24、48 h后分别统计二斑叶螨的存活情况,以勾线笔轻触螨体,螯肢不动者视为死亡。记录各组死亡和存活的数量并计算校正死亡率。

用Abbott公式计算校正死亡率。

死亡率(%)=死亡虫数/总虫数×100;

校正死亡率(%)=(处理死亡率-对照死亡率)×100/(1-对照死亡率);

室内毒力测定:根据室内药效试验的结果,设计室内毒力测定的浓度梯度,每处理5个浓度梯度,设3次重复,以清水为对照。统计浸药处理后48 h二斑叶螨死亡率,计算毒力曲线,试验方法同室内药效试验。

1.5.3 二斑叶螨解毒代谢酶比活力的测定

挑选18盆长势良好、鲜嫩的豆苗,每盆接种二斑叶螨约200头,正常饲养繁殖一周左右备用。取各中药处理中毒力效果最佳的提取物用乙醇稀释至致死中浓度后,对单盆带虫豆苗均匀喷施。以不作处理的带虫豆苗为对照,每组重复3次。于4、24 h后分别测定其体内的酶比活力。

以小号勾线笔轻取不同处理的试虫各200头,加入2 mL 0.1 mol/L 的磷酸缓冲液(多功能氧化酶MFO:匀浆时取 1 mL pH=7.3 PBS缓冲液;谷胱甘肽S-转移酶:匀浆时取 1.5 mL pH=7.5 PBS缓冲液;乙酰胆碱酯酶:匀浆时取1.5 mL pH=7.0 PBS缓冲液;羧酸酯酶:取 1.5 mL pH=7.0 PBS缓冲液;磷酸酯酶:取1.5 mL pH=7.0 PBS缓冲液)冰浴匀浆120 s,匀浆液在10 000 r/min、4℃条件下离心10 min。取上清液在10 000 r/min、4℃条件下再离心20 min,所获得的上清液用于酶活性测定。封存于-18℃环境下保存备用,避免反复冻融。

施药后4 h和24 h后,测定二斑叶螨体内总蛋白含量、乙酰胆碱酯酶(AchE)、羧酸酯酶(CarE)、酸性磷酸酯酶(ACP)、碱性磷酸酯酶(ALP)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)、多功能氧化酶(MFO)等解毒代谢酶的活力变化情况,具体原理为:

AchE催化Ach水解生成胆碱,胆碱与二硫对硝基苯甲酸(DTNB)作用生成 5-巯基-硝基苯甲酸(TNB),TNB在412 nm处有吸收峰,通过测定412 nm吸光度增加速率,计算AchE活性。

CarE:能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯,固蓝显色;在450 nm光吸收增加速率,计算CarE活性。

磷酸酯酶:酸性(碱性)条件下,酸性(碱性)磷酸酯酶可以水解反应底物对硝基苯基磷酸二钠,产生对硝基苯酚,为黄色物质。当底物充分时,该酶活性越强,所生成的对硝基苯酚也相应越多,据此可应用比色法测定该酶比活力。

GST催化GSH与CDNB 结合,结合产物的吸收峰波长为340 nm,通过测定 340 nm 波长处吸光度上升速率即可计算出GST活性。

MFO:生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中昆虫多功能氧化酶(MFO)的水平。向预先包被了昆虫MFO单克隆抗体的酶标孔中加入MFO,温育;温育后,加入生物素标记的抗MFO抗体,再与链霉亲和素-HRP结合,形成免疫复合物,再经过温育和洗涤,去除未结合的酶,然后加入底物A、B,产生蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中昆虫多功能氧化酶(MFO)的浓度呈正相关。

蛋白质测定方法采用考马斯亮蓝法。

根据预试验结果,选择致死率在20%～80%之间所对应的浓度设置5个浓度梯度,考虑试验具体操作的方便性,将试验设计所得的浓度梯度与提取率相结合,计算转换为体积分数梯度,再将所得体积分数梯度近似取整后进行试验。

1.6 数据分析方法

用SPSS 20.0软件求出毒力回归方程、LC50值、相关系数r及95%置信区间,用LSD法进行单因素方差分析。

2 试验结果

2.1 3种溶剂对5种中药的提取率

由于各有机溶剂的极性各不相同,根据相似相溶原理,不同溶剂提取出的有效成分各不相同。各中药粗提物的提取率如表4所示,C-SCZ提取率最高,达21.62%,其次为A-SCZ,提取率达19.83%。A-ZDX、A-BB、C-BX、E-ZDX等的提取率均大于10.00%,C-ZDX、E-BB的提取率低,仅为4.93%和4.92%。

表4不同溶剂对各中药粗提物的提取率

Table4Extractionrateofcrudeextractsfromdifferentplantsbythreesolvents

供试植物Plant提取率/%Extractionrate乙醇(E)Ethanol丙酮(A)Acetone氯仿(C)Chloroform百部(BB)Stemonajaponica4．9213．188．20蛇床子(SCZ)Cnidiummonnieri9．2319．8321．62紫丁香(ZDX)Syringaoblata10．1816．644．93白头翁(BTW)Pulsatillachinensis7．805．896．24半夏(BX)Pinelliaternata9．335．5011．13

2.2 不同植物粗提物对二斑叶螨的室内药效试验

当各粗提物浓度为5.00 mg/mL时,24 h和48 h的死亡率如表5所示,丙酮-蛇床子(A-SCZ)和氯仿-蛇床子(C-SCZ)均具有较高的杀螨活性,校正死亡率达100%,乙醇-白头翁(E-BTW)杀螨活性次之,24 h校正死亡率为51.48%,48 h校正死亡率为60.29%,乙醇-百部(E-BB)的24 h校正死亡率为53.38%,48 h校正死亡率为60.75%,也表现出较好的杀螨活性;其余植物粗提物对成螨的触杀效果均不太高,半夏的氯仿提取物(C-BX)杀螨活性最低,24 h校正死亡率仅为10.63%,48 h校正死亡率为14.67%。

表55种植物的不同溶剂粗提物校正死亡率1)

Table5Correctedmortalitiescausedbythecrudeextractsfrom5kindsofplantswithdifferentsolvents

粗提物种类Solventextract24h死亡率/%Mortality校正死亡率/%Correctedmortality48h死亡率/%Mortality校正死亡率/%Correctedmortality乙醇⁃百部(E⁃BB)Ethanol⁃S．japonica(53．95±1．15)b (53．38±1．17)b(66．17±1．11)b(60．75±1．16)b乙醇⁃蛇床子(E⁃SCZ)Ethanol⁃C．monnieri(36．13±6．97)c(35．48±7．10)c(44．07±11．52)de(37．16±12．07)de乙醇⁃紫丁香(E⁃ZDX)Ethanol⁃S．oblata(28．25±13．12)cd(27．52±13．38)cd(32．14±7．10)ef(23．75±7．43)ef乙醇⁃白头翁(E⁃BTW)Ethanol⁃P．chinensis(51．96±6．26)b(51．48±6．39)b(64．65±10．84)bc(60．29±11．35)bc乙醇⁃半夏(E⁃BX)Ethanol⁃P．ternata(35．91±12．44)c(34．47±12．68)c(46．11±22．29)de(38．84±23．34)de丙酮⁃百部(A⁃BB)Acetone⁃S．japonica(15．00±0．13)e(11．46±0．13)e(22．00±5．64)gf(15．22±5．91)gf丙酮⁃蛇床子(A⁃SCZ)Acetone⁃C．monnieri(100．00±0．00)a(100．00±0．00)a(100．00±0．00)a(100．00±0．00)a丙酮⁃紫丁香(A⁃ZDX)Acetone⁃S．oblata(20．39±2．27)de(17．07±2．32)de(28．98±7．90)gf(22．80±8．27)gf丙酮⁃白头翁(A⁃BTW)Acetone⁃P．chinensis(19．00±3．44)de(15．63±3．51)de(24．00±2．57)gf(17．39±2．69)gf丙酮⁃半夏(A⁃BX)Acetone⁃P．ternata(32．07±2．69)c(29．31±2．74)c(50．88±6．28)cd(44．58±6．57)cd氯仿⁃百部(C⁃BB)Chloroform⁃S．japonica(35．15±6．95)c(33．83±7．08)c(43．76±7．72)de(34．61±8．08)de氯仿⁃蛇床子(C⁃SCZ)Chloroform⁃C．monnieri(100．00±0．00)a(100．00±0．00)a(100．00±0．00)a(100．00±0．00)a氯仿⁃紫丁香(C⁃ZDX)Chloroform⁃S．oblata(37．22±6．74)c(35．94±6．87)c(43．83±5．56)de(34．69±5．82)de氯仿⁃白头翁(C⁃BTW)Chloroform⁃P．chinensis(38．00±3．37)c(36．73±3．43)c(51．00±5．92)d(47．02±6．20)d氯仿⁃半夏(C⁃BX)Chloroform⁃P．ternata(11．47±2．54)e(10．63±2．59)e(17．14±3．00)g(14．67±3．15)g

1) 表中数据为3次重复的平均值。同列不同小写字母表示各处理间死亡率有显著性差异(P<0.05)。 Data are the means of 3 replicates. Different lowercase letters in the same column indicate that there were significant differences in mortality among the treatments (P<0.05).

2.3 5种植物粗提物对二斑叶螨成虫的室内毒力测定

选取杀虫活性较高的蛇床子丙酮提取物A-SCZ、蛇床子氯仿提取物C-SCZ、百部乙醇提取物E-BB、白头翁乙醇提取物E-BTW、白头翁氯仿提取物C-BTW,配成浓度梯度分别为A-SCZ:3.96、2.97、1.98、0.99、0.50 mg/mL;C-SCZ:5.40、2.70、1.35、0.68、0.34 mg/mL；E-BB:7.35、6.13、4.90、2.45、0.98 mg/mL；E-BTW:19.50、15.60、11.70、7.80、3.90 mg/mL；C-BTW:10.85、9.30、7.75、4.65、1.55 mg/mL;各5个浓度梯度,对二斑叶螨成虫进行毒力测定。结果如表6所示,5种植物粗提物对二斑叶螨成虫均表现出较好的触杀效果,LC50分别为2.68、1.68、4.14、11.91、5.93 mg/mL,LC50最小的C-SCZ的毒力为LC50最高的E-BTW毒力的7.27倍,试验表明,蛇床子的氯仿粗提物和丙酮粗提物对成螨的触杀效果最好。

2.4 二斑叶螨解毒代谢酶活性变化

选取杀虫活性较高的A-SCZ、C-SCZ、E-BB、E-BTW、C-BTW 5种植物粗提物,测定其对二斑叶螨体内主要的解毒代谢酶活性的影响,施药4 h和24 h后二斑叶螨体内酶活如表7所示。

处理4 h后各处理组蛋白浓度均高于正常水平,且有显著性差异(P<0.05)。各处理组AchE均受到显著的抑制(P<0.05),4个处理间被抑制的程度无差异;GST在各处理组中也受到显著的抑制(P<0.05),其中蛇床子和百部处理组受到的抑制最强,显著不同于紫丁香处理组(P<0.05);ACP、ALP、CarE在各处理中均受到了显著的抑制(P<0.05),处理间无明显差异。白头翁、紫丁香、蛇床子处理组MFO的活性在用药后均有显著的提升(P<0.05),百部处理组的MFO受到抑制。

表65种中药粗提物对二斑叶螨成虫的室内毒力测定

Table6Indoortoxicitydeterminationof5kindsofcrudeextractsagainstTetranychusurticae

粗提液Solventextract回归方程Regressionequation相关系数CorrelationcoefficientLC50/mg·mL-1MedianlethalconcentrationLC50置信区间/mg·mL-1Confidenceinterval相对毒力倍数RelativevirulencefactorC⁃SCZ Chloroform⁃C．monnieriy=4．77x+1．000．931．681．08～2．661．00A⁃SCZ Acetone⁃C．monnieriy=4．61x+0．910．902．681．53～4．691．59E⁃BB Ethanol⁃S．japonicay=4．03x+1．570．984．143．13～5．482．46E⁃BTW Ethanol⁃P．chinensisy=2．63x+2．200．9711．919．78～14．517．27C⁃BTW Chloroform⁃P．chinensisy=3．54x+1．890．935．934．71～7．463．52

表7各植物粗提物处理4h后二斑叶螨体内酶活1)

Table7TheenzymeactivitiesofTetranychusurticaeaftertreatmentwithdifferentcrudeextractsfor4hours

粗提物Crudeextract蛋白/μg·mL-1ProteinAchE/nmol·(min·mg)-1GST/nmol·(min·mg)-1ACP/nmol·(min·mg)-1ALP/nmol·(min·mg)-1CarE/nmol·(min·mg)-1MFO/nmol·(min·mg)-1E⁃BTWEthanol⁃P．chinensis(155．66±13．27)ab(6．11±3．21)b(68．59±9．26)bc(0．23±0．00)b(3．59±0．78)b(5．67±1．09)b(31．20±0．62)cC⁃ZDXChloroform⁃S．oblata(162．90±1．12)a(7．00±2．50)b(146．45±8．64)b(0．30±0．01)b(5．13±1．58)b(6．51±0．81)b(42．50±0．62)aC⁃SCZChloroform⁃C．monnieri(145．38±2．04)b(10．07±3．57)b(29．01±5．22)c(0．48±0．01)b(5．23±1．12)b(5．60±0．43)b(37．98±0．41)bE⁃BBEthanol⁃S．japonica(166．97±3．04)a(1．96±0．69)b(70．28±1．95)bc(1．69±0．04)b(7．39±0．17)b(12．73±1．37)b(1．15±0．05)e未处理CK(17．99±1．58)c(54．09±8．10)a(716．98±30．17)a(13．39±1．84)a(58．75±5．79)a (74．57±14．37)a(2．98±0．02)d

1) 同列不同小写字母表示各处理间酶活含量有显著性差异(P<0.05)。 Different lowercase letters in the same column indicate that there were significant differences in enzyme activity among the treatments (P<0.05).

处理24 h后白头翁、紫丁香、蛇床子处理组蛋白浓度显著高于正常水平(P<0.05),百部处理组蛋白浓度与正常水平无差异。白头翁、紫丁香、蛇床子处理组AchE均受到显著的抑制(P<0.05),百部处理组活性与正常水平无明显差异;GST在各处理组中也受到显著的抑制,其中白头翁处理组受到的抑制最强,显著不同于其他3个处理组(P<0.05);白头翁、紫丁香、蛇床子处理组的ACP、ALP、CarE均受到了显著的抑制(P<0.05),且处理间无明显差异,百部处理组的ACP、ALP、CarE活性均显著高于正常水平(P<0.05)。白头翁、紫丁香、蛇床子、百部处理组MFO的活性在用药后均有显著的提升,且各处理间有明显的差异(P<0.05)。

表8各植物粗提物处理24h后二斑叶螨体内酶活变化情况1)

Table8TheenzymeactivitiesofTetranychusurticaeaftertreatmentwithdifferentcrudeextractsfor24hours

粗提物Crudeextract蛋白/μg·mL-1ProteinAchE/nmol·(min·mg)-1GST/nmol·(min·mg)-1ACP/nmol·(min·mg)-1ALP/nmol·(min·mg)-1CarE/nmol·(min·mg)-1MFO/nmol·(min·mg)-1E⁃BTWEthanol⁃P．chinensis(200．54±6．31)a(2．17±0．67)b(65．32±5．31)d(0．45±0．05)c(5．67±1．12)c(6．45±0．91)c(72．14±3．21)aC⁃ZDXChloroform⁃S．oblata(108．84±9．54)b(11．55±1．25)b(288．16±16．34)b(2．25±0．63)c(6．69±0．83)c(4．15±0．63)c(19．63±1．67)cC⁃SCZChloroform⁃C．monnieri(121．36±11．83)b(12．23±0．93)b(177．15±12．34)c(1．23±0．05)c(7．79±2．03)c(3．26±0．79)c(43．75±2．21)bE⁃BBEthanol⁃S．japonica(8．15±1．14)c(60．60±9．85)a(335．68±35．23)b(33．14±2．23)a(90．67±5．21)a(226．85±13．64)a(8．10±0．79)d未处理CK(21．17±3．85)c(58．89±5．10)a(700．13±25．16)a(15．62±1．66)b(61．33±4．73)b(85．62±16．52)b(4．45±0．24)e

1) 同列不同小写字母表示各处理间酶活含量有显著性差异(P<0.05)。 Different lowercase letters in the same column indicate that there were significant differences in enzyme activity among the treatments (P<0.05).

3 结论与讨论

本试验研究了15种中药粗提物对二斑叶螨成虫的毒杀活性,结果表明48 h校正死亡率大于60%的有4种,其中两种为蛇床子丙酮和氯仿提取物。蛇床子属于伞形科Umbelliferae蛇床属Cnidium植物,为中华人民共和国药典规定的道地药材,具有很高的药用价值。已有部分学者对蛇床子的杀虫活性进行了初步的研究,马丽娜等在研究伞形科中草药乙醇提取物的杀螨活性中指出蛇床子的乙醇粗提物对柑橘全爪螨Panonychuscitri的24 h校正死亡率为52.12%,杀螨活性较弱[23],这与本试验结果类似。李雪娇研究了蛇床子丙酮提取物对黏虫Mythimnaseparata的毒杀活性,其72 h死亡率为63.3%。姚英娟等研究了蛇床子无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚4种溶剂提取物对玉米象Sitophiluszeamais、谷蠢和锯谷盗Oryzaephilussurinamensis成虫的驱避和触杀作用,结果表明除石油醚提取物对锯谷盗96 h的校正死亡率为20%以外,其余粗提物对3种试虫的触杀效果均较高[24]。从已有结果来看,蛇床子乙醇提取物对鞘翅目昆虫具有较高的触杀活性,而对蜱螨目等刺吸式害虫触杀效果不明显,而丙酮提取物相对广谱,对各种害虫都具有较高的毒杀活性。

蛇床子的主要药理活性成分是香豆素类化合物和挥发油,以及单萜多醇、糖类和倍半萜类成分等[25],姚英娟推测其主要的触杀活性物质为香豆素类的蛇床子素[24],本试验用极性不同的溶剂获得的粗提物在较低浓度范围内均有较高杀虫活性,根据物质极性相似相溶原理,推测蛇床子杀螨活性成分可能有多种。具体活性物质的确定需通过进一步的试验探索。

本研究发现虽然紫丁香乙醇提取物处理的成螨校正死亡率不高,但供试成螨均表现呆滞,活跃度低,故推测紫丁香乙醇提取物对二斑叶螨具有迟效性,致死时间要长于其他药剂,需在后续的田间药效试验中进一步验证。另外通过观察发现,百部乙醇提取物可使成螨虫体体壁普遍变薄,一触即破,其作用机理需进行进一步研究。

王兰英等研究表明百部丙酮粗提物对螺旋粉虱Aleurodicusdisperses有较高的触杀作用(LC50为4.046 7 mg/mL)[26]。但在本试验中,百部丙酮粗提物对二斑叶螨作用的LC50高达36.920 4 mg/mL,与其研究结果有较大出入,分析原因可能有以下几方面:供试虫源的种类不同,对提取物反应也不同,在化学农药中,杀螨剂和杀虫剂常表现出很大不同;提取方法不同也能导致活性有较大差异。

酶活变化结果表明,白头翁、紫丁香、蛇床子的活性成分主要抑制二斑叶螨体内乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶、磷酸酯酶和羧酸酯酶而发挥杀螨作用,而百部粗提物主要抑制的是害螨体内谷胱甘肽S-转移酶和多功能氧化酶。操海群等2006年用巨县苦竹等竹提取物处理棉铃虫幼虫后,幼虫体内羧酸酯酶等解毒酶系的活性显著降低[27],陈青等研究锡兰肉桂丙酮粗提物对皮氏叶螨体内解毒代谢酶的关系[28],与本文结果类似。但陈青等对大叶丁香丙酮提取物对皮氏叶螨代谢酶活性进行研究[29],得出丁香丙酮提取物能激活害虫体内酸性磷酸酯酶的活性,与本文紫丁香抑制二斑叶螨体内酸性磷酸酯酶的结果有出入,其原因可能是皮氏叶螨和二斑叶螨存在种间差异。根据酶活性的变化可以有助于分析中药杀螨活性物质的成分及其药效机理,从而对杀螨物质的提取提供有益帮助。

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(责任编辑： 田 喆)

EfficacyofmiticidalactivityofthecrudeextractsofsomeChinesemedicinesagainstTetranychusurticae

Song Shanshan, Wang Hui, Wang Zhangxun, Wang Xinpu

(CollegeofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China)

The miticidal activity of 15 kinds of crude extracts from five Chinese medicines , includingCnidiummonnieri,Pulsatillachinensis,Stemonajaponica,PinelliaternataandSyringaoblateby three different solvents were determined againstTetranychusurticaeby using the slide-dip method. The bioassay results showed that the corrected death rate ofT.urticaewas 100% at 24 h after treated with 5.00 mg/mL acetone-C.monnieri(A-SCZ) and chloroform-C.monnieri(C-SCZ), which showed a good miticidal activity. The virulence of acetone-C.monnieri(A-SCZ), chloroform-C.monnieri(C-SCZ), ethanol-S.japonica(E-BB), ethanol-P.chinensis(E-BTW) and chloroform-P.chinensis(C-BTW) crude extracts againstT.urticaewas measured. The results showed that the LC50values were 2.68 mg/mL, 1.68 mg/mL, 4.14 mg/mL, 11.91 mg/mL, 5.93 mg/mL, respectively. The activities of acetylcholinesterase, carboxylic acid esterase, acid phosphatase, alkaline phosphatase, glutathioneS-transferase, multi-function oxidase ofT.urticaewere determined at 4 h and 24 h after application of the extracts. The results showed that the active ingredients ofP.chinensis,S.oblate, andC.monnieriinhibited acetylcholinesterase, glutathioneS-transferase, phosphatase and carboxylesterase ofT.urticae, butS.japonicainhibited glutathioneS-transferase and multi-function oxidase ofT.urticae. The extraction rates of acetone-C.monnieri(A-SCZ) and chloroform-C.monnieri(C-SCZ) were 19.83% and 21.62%, respectively. Because of the high extraction rate and high acaricidal activity, these two crude extracts have great potential for development.

crude extract of Chinese medicine;Tetranychusurticae;Cnidiummonnieri;Pulsatillachinensis;Stemonajaponica;Pinelliaternata;Syringaoblata; miticidal activity; metabolic detoxification enzyme

S 482.1

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.012

2016-11-23

： 2017-04-20

教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-07-0470)；宁夏“十三五”重点研发计划项目(2016BZ09)

* 通信作者 E-mail: meloidae@126.com