基于全基因组编码区序列的烟草花叶病毒分子进化分析

刘天波, 周志成, 彭曙光, 曾维爱, 唐前君

(1. 湖南省烟草科学研究所, 长沙 410004; 2. 湖南省烟草公司, 长沙 410004;3. 湖南省长沙市烟草公司, 长沙 410010; 4. 湖南农业大学植物保护学院, 长沙 410128)

基于全基因组编码区序列的烟草花叶病毒分子进化分析

刘天波1,4, 周志成1, 彭曙光2, 曾维爱3, 唐前君4*

(1. 湖南省烟草科学研究所, 长沙 410004; 2. 湖南省烟草公司, 长沙 410004;3. 湖南省长沙市烟草公司, 长沙 410010; 4. 湖南农业大学植物保护学院, 长沙 410128)

为揭示烟草花叶病毒分子进化特征,从GenBank中下载已报道的烟草花叶病毒全基因组编码区序列,进行重组、系统发育、遗传变异、种群结构和基因漂流等分析。结果表明:突变和负选择作用是驱动烟草花叶病毒进化的主要作用力,种群结构稳定,处于扩张趋势中,基因变异程度低,重组在烟草花叶病毒分子进化中作用不明显。烟草花叶病毒不同分离物形成3个有一定地理相关性的种群ChinaⅠ、China Ⅱ和Europe。欧洲分离物核苷酸序列多样性比中国的差异大,Europe和ChinaⅠ种群可能受到遗传漂变影响,Europe与China Ⅱ、ChinaⅠ与China Ⅱ之间存在发生基因交流的渠道。

烟草花叶病毒; 全基因组编码序列; 系统发育; 分子进化

烟草花叶病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)是烟草花叶病毒属Tobamovirus的代表成员,是危害最严重的病毒之一[1]。由TMV侵染引起的烟草花叶病在全世界烟草栽培地区普遍发生,已成为威胁中国烟叶生产的主要病害之一,且近年来呈日趋严重的趋势[2]。TMV寄主范围广,可侵染30 个科、310 多种植物,地理分布广泛,分布于中国、韩国、西班牙和美国等多个国家[3-6]。TMV具有较多的株系,目前没有统一的划分标准,主要株系有TMV-OM、TMV-U1、TMV-Vulgare、TMVRS、TMVC、TMVN、TMVY[7-8]。TMV是一种正单链RNA病毒,基因组全长6 395个核苷酸(nucleotide, nt),共编码4 个开放阅读框(open reading frame, ORF),ORF1编码126 kD的蛋白质,其终止密码子(UAG)是渗漏性的(leaky),产生了一个较大的183 kD的通读蛋白ORF2,ORF2的末端5个密码子与编码30 kD蛋白质的ORF3重叠,ORF3终止于ORF4的起始密码子前两个核苷酸的位置,ORF4编码17.6 kD的外壳蛋白[9-10]。

目前,源于不同国家或地区、不同寄主病毒分离物的基因序列不断被报道,通过生物信息学技术和方法对这些序列加以分析和研究,明确病毒不同分离物的起源、亲缘关系、遗传变异和分子进化,了解全球范围内或地域内病毒的发展动态和趋势,对监测和防控病毒病具有重要意义。但是,这类分析是建立在一定数量的病毒株系(或分离物) 序列基础上,部分病毒由于报道的全序列或编码区序列数量有限,目前还无法全面分析其变异进化规律和株系间亲缘关系特征,另外基于一个或多个基因进行分析,其结果往往带有一定的片面性。贾琳等[11]对猪瘟病毒Classicalswinefevervirus(CSFV) 基因组全编码区进行了选择压力及重组分析,发现重组改变了重组株所在的进化树分支,影响了CSFV 的遗传多样性,针对宿主免疫系统的选择压力而产生的突变和重组推动了病毒编码区基因的进化。张新珩等[12]对鸡传染性贫血病毒Chickenanemiavirus(CAV)全基因组编码区进行变异点和分子进化分析,监测了广东省CAV序列变异情况及流行特点。这类基于基因组全编码区的分子进化分析, 其分析结果更具参考价值。

TMV全基因组序列的报道不断增加,研究多集中在单一序列的结构分析上,如复制酶、移动蛋白 (movement protein, MP)、外壳蛋白(coat protein, CP)序列结构分析[13-15]等。但对来自不同国家或地区、不同寄主上的TMV株系或分离物,其起源、变异或重组、种群结构、进化机制等方面研究却鲜有报道。本研究以目前已报道的TMV 全基因组编码区序列为研究对象,进行重组、系统发育、遗传变异、基因交流和种群结构分析,揭示TMV分子变异进化特征,为TMV的抗病育种和防治提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

从 NCBI 上下载目前已报道的所有的TMV 分离物全基因组序列(截至2016年10月31日),共获得72条TMV分离物全基因序列,并选取2株近缘物种番茄花叶病毒Tomatomosaicvirus(ToMV)分离物作为外群。

1.2 方法

1.2.1 序列数据处理

用BioEdit[16]对所有的数据进行修正处理,去掉序列中存在的瑕疵并删除终止密码子。将整理后的序列用ClustralX2[17]比对,这种比对产生的结果可能存在部分 gap 不是 3 的倍数,因此将核苷酸序列数据对应的氨基酸序列再用 TransAlign[18]软件比对,以保证经过序列比对后得到的核苷酸序列能够正确地编译出氨基酸序列。TMV的分离物ORF3和ORF4之间一般存在基因间隔区,经过上述一系列的序列处理后,去掉基因间隔区,然后将所有的ORF组装在一起进行后续的分析。

1.2.2 重组分析

利用RDP4.0[19]软件包中的 RDP、Geneconv、Bootscan、Maxchi、Chimaera、3Seq和 Siscan检测可能存在的重组位点,利用SimPlot软件进行检测验证重组位点存在的可能性。当某分离物出现4个软件的检测结果都是P<1.0×10-6时,则该分离物有可能的重组,否则没有重组或不存在潜在重组[20]。使用软件时采用系统默认值,设定置信值(P-value)为0.01。

1.2.3 系统发育分析

采用MEGA 5.0中的Clustral W[21]软件进行序列比对,利用最大似然法(maximum likelihood, ML)构建系统进化树,重复1 000次。在 ML 法分析中,数据最适的核苷酸替代模型用 jModelTest 0.1.1 软件[22]计算,结果显示TRG+I+G为最适的核苷酸替代模型;在 ML分析中采用自举法,进行1 000倍模拟复制计算支长。

1.2.4 遗传差异以及基因交流

种群之间的遗传差异由 DnaSP 5.0[23]软件计算,统计Ks,Z和Snn三个参数衡量[24-25]。如果Ks和Z统计值很小,P<0.05,则认为存在遗传差异。基因交流用Fst和Nm值来衡量,Fst的绝对值小于0.33,说明两个种群之间存在基因交流,反之,交流不频繁[26-27]。若Nm<1,则说明在种群间很容易发生基因漂变,是群体发生遗传差异的主要原因;若Nm>1则说明种群间存在可以发生基因交流的渠道或者地缘关系较近。

1.2.5 选择压力分析

将分离物按寄主和地理来源分为不同的组,应用 MEGA5.0 软件中Pamilo-Bianchi-Li法分别计算非同义和同义突变之间的比值(dN/dS)[28]。若dN/dS=1则说明该组分离物存在中性选择;若dN/dS<1则说明该组分离物存在负选择或净化;若dN/dS>1 则说明该组分离物存在正向选择或多样化选择。

1.2.6 突变位点和保守区域分析

利用DnaSP 5.0软件,对TMV编码区基因序列5 937个位点进行突变位点和保守区域分析。

1.2.7 种群结构分析

不同种群分离物的核苷酸多样性与单体型多样性采用 DnaSP 5.0软件计算。基于Tajima’s D和Fu & Li’s D和F值进行中性检验分析,Tajima’s D和Fu & Li’s D和F均为负值,说明该种群多样性较低,种群呈扩张趋势;相反,种群稳定选择,种群数量正在减少[29-30]。

2 结果与分析

2.1 重组分析

对处理后得到的72个分离物全基因组编码区序列进行重组分析,结果发现分离物的P值皆大于1.0×10-6,没有发现明显的重组位点。为了进一步确认这一结果,运用SimPlot再次检测依然没有发现明显的重组位点。因此,可以确认在TMV分离物中不存在重组体或者不明显。

2.2 系统发育分析

对已报道的72个TMV全基因组编码区序列进行分析,如图1所示,TMV不同分离物形成3个种群,分别为ChinaⅠ、 China Ⅱ和 Europe, ChinaⅠ聚集了除云南外中国各地区分离物,China Ⅱ以云南分离物为主体,Europe除了少部分中国分离物以外,绝大部分来源于西班牙和美国,不同组间的分离物地理特征明显。

2.3 遗传差异以及基因交流

利用Ks、Z和Snn三个统计量对TMV全基因组编码区序列的欧洲和中国(China Ⅰ、China Ⅱ)不同种群间的遗传变异进行了分析,结果表明Ks和Z统计值很小,P<0.001(表1),TMV在不同群组间的遗传变异明显,同时中国不同地区间形成的种群遗传差异也十分明显。在基因流动分析中,TMV不同组间和中国不同地区种群间的Fst<0.33,表明TMV在不同种群间基因交流的频率较高。TMV Europe和China Ⅰ种群Nm<1,表明种群可能受到遗传漂变的影响,Europe和China Ⅱ,China Ⅰ和China Ⅱ之间的Nm>1,表明种群间存在可以发生基因交流的渠道。

表1TMV的基因流动和遗传差异1)

Table1GeneflowandgeneticdifferentiationofTMV

谱系及序列数Lineageandnumberofsequences参数 ParameterKs(P⁃valve)Z(P⁃valve)Snn(P⁃valve)FstNmEurope(n=18)vs．ChinaⅠ(n=35)4．09543(0．0000∗∗∗)370．34408(0．0000∗∗∗)0．97917(0．0000∗∗∗)0．241850．78Europe(n=18)vs．ChinaⅡ(n=19)4．11881(0．0000∗∗∗)272．17317(0．0000∗∗∗)0．94054(0．0000∗∗∗)0．165362．52ChinaⅠ(n=35)vs．ChinaⅡ(n=19)4．38052(0．0000∗∗∗)711．91951(0．0000∗∗∗)0．93220(0．0000∗∗∗)0．129043．39

1)*, 0.01

2.4 选择压力分析

TMV所有分离物的dN/dS的比率均远小于1(表2),突变为非同义突变,这表明TMV不同种群都处于较强的负选择压力下,受到自然界的纯化选择作用。

表2TMV选择压力分析1)

Table2SelectionpressureanalysisofTMV

谱系Lineage序列数Numberofsequences核苷酸多样性 NucleotidediversitydNdSdN/dSEurope180．02038±0．001040．12667±0．005750．16089ChinaⅠ350．00369±0．000380．03845±0．002580．09597ChinaⅡ190．00397±0．000510．04066±0．002710．09763All720．00902±0．000510．07273±0．002730．12402

1) 表中数据为dN±标准差、dS±标准差。下同。 Data in the table aredN±SD,dS±SD. The same below.

图1 基于TMV全基因组编码区序列采用最大似然法(ML)构建树Fig.1 Maximum likelihood tree calculated based on the complete genomic coding sequences of TMV

2.5 种群结构分析

在TMV分离物种群间的核苷酸序列差异介于0.013 45±0.000 74和 0.043 49±0.001 35之间,欧洲分离物核苷酸序列多样性值比中国的差异大,单体型差异介于0.980±0.028和0.997±0.008之间,ChinaⅠ种群单体型差异更大(表3)。

表3TMV的核苷酸和单体型差异比较

Table3ComparisonofthenucleotideandhaplotypediversitiesofTMV

谱系Lineage序列数Thenumberofsequences差异值 Differences核苷酸多样性Nucleotidediversity单体型多样性HaplotypediversityEurope180．04349±0．001350．980±0．028ChinaⅠ350．01345±0．000740．997±0．008ChinaⅡ190．01457±0．000750．994±0．019All720．02560±0．000890．998±0．003

2.6 突变位点和保守区域分析

突变位点分析发现有可变位点1 423个,单突变位点604个,其中两个变异型569个,三个变异型35个,简约信息位点819个,其中两个变异型643个,三个变异型168个,四个变异型8个。

保守区域分析发现 TMV整个编码区的保守性(Sequence conservation)高达0.76,基因编码的氨基酸保守值(conservation threshold)高于0.85的保守区域共有6个(conserved regions)(表4)。由此可见,TMV基因编码区突变率很低,比较保守。

表4TMV基因编码区的保守区域

Table4ConservedregionsofthecodingsequencesofTMV

保守区域ConservedRegion位置Location保守性Sequenceconservation一致性ConsistencyP值P⁃value1814～9260．8760．9880．001522068～21890．8690．9890．002033569～36380．8710．9910．015743583～36520．8860．9940．006654609～47400．8790．9940．000464744～48540．8740．9930．0020

2.7 中性检测分析

TMV不同组间的中性检测统计值均为负值,说明TMV种群多态性较低,处于扩张趋势(表5)。总体而言,在独特的地理分组中进行3个中性平衡模型偏差分析,连同其高单体型多样性及低核苷酸多样性,揭示了TMV种群在扩张。

表5TMV的中性检测

Table5NeutralitytestsofTMV

谱系Lineage序列数NumberofsequencesTajima’sDFu&Li’sDFu&Li’sFEurope18-1．95277-2．22788-2．46792ChinaⅠ35-1．92283-1．59870-2．03697ChinaⅡ19-1．23199-1．16993-1．39933All72-2．40321-4．59602-4．42311

3 结论与讨论

关于TMV基因组的研究多集中在TMV分离物复制酶、MP、CP 序列结构或比较分析方面,而对TMV分子变异进化报道很少。对TMV全基因组编码区序列进行了重组、系统发育、遗传变异、基因交流和种群结构分析,结果表明TMV分离物没有明显的重组体,所有的分离物可以分为ChinaⅠ、China Ⅱ和Europe 3个种群,种群间具有比较明显的地理相关性。在不同群组间的遗传变异明显,基因交流的频率较高,Europe和ChinaⅠ种群可能受到遗传漂变影响,Europe和China Ⅱ、ChinaⅠ和China Ⅱ之间存在可以发生基因交流的渠道。TMV欧洲分离物核苷酸序列多样性值比中国的差异大,ChinaⅠ种群单体型差异较大,地缘关系较近的不同种群都处于较强的负选择压力下,并处于扩张趋势中,负选择和突变是潜在的驱动TMV分子进化的动力,自然选择是TMV进化过程中的有效推动力。

在植物 RNA 病毒中,重组是遗传多样性的重要来源,也是促进进化的主要动力之一[31],如马铃薯 Y 病毒科Potyviridae中重组发生特别频繁,对塑造PVY种群遗传结构产生很重要的影响[32]。重组不仅能帮助病毒适应新寄主或扩大寄主范围,也可使病毒的致病力发生改变从而更加适应当地的环境。但在不同 RNA 病毒间重组率差异很大,对 TMV全基因组的编码区进行重组分析中,并没有发现重组现象。尽管由于分离物数量以及来源地比较单一等方面的限制,可能导致某些重组体未被发现,但是相对于 PVY重组在驱动TMV进化方面,不能起到与其类似的作用[33]。中国TMV的发生率一直相对比较稳定,可能与TMV不存在重组株系有一定的关系。

系统发育分析中,TMV分离物形成3个相对独立的种群,种群间具有一定的地理特异性。ChinaⅠ聚集了除云南外中国各地区分离物,China Ⅱ以云南、贵州、四川分离物为主体,TMV 中国分离物在不同省份间形成两个独立的分支,遗传变异明显,可能不同种群独立进化。Europe种群绝大部分来源于西班牙和美国,但也有个别中国分离物,表明TMV种群在中国与欧洲之间交流较频繁。TMV 3个种群起源于何处?又是怎样传播的?什么因素导致云南分离物与中国其他地区分离物种群间有明显遗传差异?推测中国种群起源有可能与烟草传入中国有关,中国种群由美洲(美国)迁入欧洲(西班牙),再由欧洲进入中国,在中国又分为南北两条途径,可能由于地理阻隔等原因导致各自独立进化,形成了云南和其他地区种群,因不同地区间烟草种苗交流传播,使得两个种群间既有遗传差异,也有基因相互交流。对于这个推测,尚需要进一步的试验验证。

病毒在寄主体内是以“突变云”或者“准种”形式存在,突变是驱动 TMV 进化的主要作用力之一。利用dN/dS的值,计算选择压力,大部分植物病毒处于强的负选择压力下。TMVdN/dS远小于 1,表明 TMV 进化受到强的负选择压力的驱动,自然选择是其进化的主要驱动力。变异分析发现TMV 的种群遗传结构相对比较稳定,基因组序列变异较少,比较保守,这与宋丽云[34]的研究结果一致;而谢扬军[35]解释各分离物之间的差异,是由于TMV 主要以点突变的方式来适应不同的生态环境带来的选择压力而造成的。

大量的研究表明,培育抗病毒品种是植物病毒病害防治经济有效的方法之一。但植物病毒一般具有广泛的寄主和较强的地域适应性,在与寄主植物互作过程中,易发生株系分化和变异,造成抗病品种抗性的减弱和丧失,使抗病毒育种工作难度加大。要减轻或者消除TMV对烟草等作物生长所带来的不利影响,培育抗病毒品种,必须弄清病毒的遗传变异机制,开展种群遗传研究,追踪病毒的起源、进化以及流行途径,才能为抗病毒病育种提供指导。深入分析TMV的重组、系统发育、遗传变异、种群结构等分子进化机制,结果表明TMV种群间不存在重组现象,种群结构相对稳定,基因组序列变异少,因此培育抗病毒品种可能是防治TMV持久有效的方法之一。本研究开展的TMV 全基因组编码区序列分子进化分析,深入揭示TMV分子变异进化特征,对TMV的抗病育种和病害防治具有重要意义。

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(责任编辑： 田 喆)

Completegenomiccodingsequence-basedmolecularevolutionaryanalysisofTobaccomosaicvirus

Liu Tianbo1,4, Zhou Zhicheng1, Peng Shuguang2, Zeng Wei’ai3, Tang Qianjun4

(1.TobaccoResearchInstituteofHunanProvince,Changsha410004,China; 2.TobaccoCompanyofHunan,Changsha410004,China; 3.TobaccoCompanyofChangsha,Hunan410010,China;4.CollegeofPlantProtection,HunanAgriculturalUniversity,Hunan410128,China)

To reveal the molecular evolution ofTobaccomosaicvirus(TMV), the complete genomic coding sequences of TMV from GenBank were subjected to molecular evolutionary analysis, including recombination, phylogeny, genetic variation, population structure, gene flow, etc. The results indicated that mutation and negative selection were the main driving forces for TMV evolution, rather than recombination. The TMV populations had stable structure, but were expanding, and the gene mutation was low. Three geographically correlative species of TMV named ChinaⅠ, China Ⅱand Europe were found. The Europe isolates exhibited greater nucleotide diversity than the China ones; Europe and ChinaⅠpopulations could be influenced by genetic drift, and there were gene exchange channels between Europe and China Ⅱ and between ChinaⅠand China Ⅱ.

Tobaccomosaicvirus; complete genomic coding sequence; phylogenetics; molecular evolution

S 435.72

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.013

2016-12-19

： 2017-01-23

中国烟草总公司湖南省公司科技项目专项(14-16ZDAa02);中国烟草总公司科技重点项目(110201502016)

* 通信作者 E-mail:78405158@qq.com