一起牦牛病毒性腹泻病原学诊断

马吉云 （青海省创业发展孵化器有限公司 810003）

一起牦牛病毒性腹泻病原学诊断

马吉云 （青海省创业发展孵化器有限公司 810003）

青海省祁连县某牦牛养殖场发生以腹泻为主要特征的疾病，传播迅速，发病率为100%，初步怀疑为牦牛病毒性腹泻，为此采集了2腹泻样本，采用Trizol方法提取腹泻粪便的总RNA，利用我们设计合成的引物采用RT-PCR方法进行病原检测，结果得出这两腹泻样本均扩增出病毒性腹泻病原产物，测序结果表明该场犊牦牛腹泻由牦牛病毒性腹泻病原引起。

病毒性腹泻；病原；牦牛

牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV），又称牛病毒性腹泻/黏膜病毒 (Bovine Viral Diarrhea/Mucosal Disease Virus，BVDV/MDV），在分类学上属于黄病毒科 (Flaviviridae），瘟病毒属 (Pestivirus）BVDV感染牛后，能引起牛的多种临床，如高热，白细胞减少，沉郁，厌食，下痢，大量流涎，减奶以至停奶，消化道黏膜糜烂，坏死，胃肠炎，孕牛流产或产出崎形胎儿等[1-3]。目前，犊牛腹泻已经成为危害养牛业的一种重要疾病，犊牛腹泻主要症状表现为消化道病变，该病一年四季均可发生，尤以气候交替的初春和夏秋季节多发，引起犊牛腹泻的因素众多，既有病毒、细菌和寄生虫等病原引起的感染性因素也有由营养和环境原因造成的非感染性因素[4-5]。其中，病原微生物感染是造成犊牛腹泻的重要原因，常见的引起犊牛腹泻的病原主要有轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒而又以BVDV最为常见[6-7]，这几类病原的临床症状和病理变化及其相似，现场难以确诊，需要进行试验的检测来进行确认。本试验对青海省祁连县某牦牛养殖场的两腹泻样本进行BVDV的RTPCR检测，从而确诊了引起该场犊牛腹泻的主要病原为BVDV，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 样本

样本为两份发病犊牦牛腹泻粪便 (无菌采集），2017年3月采于青海省祁连县某养殖场的3月龄发病犊牦牛，临床表现为腹泻，脱水，粪便呈灰白色或深绿色粪便，带有血便。

1.2 试剂

BVDV oregonC24V，YAK毒株购自中国兽医药品监察所。IPTG、Amp、RT-PCR试剂盒、Trizol均购自宝生物工程有限公司，微量胶回收试剂盒购自北京天根试剂公司，DEPC试剂购自Sigema生物公司。

1.3 参考毒株

BVDV oregonC24V，YAK毒株购自中国兽医药品监察所。

1.4 引物设计与合成

参照NCBI上发表的BVDV毒株基因组序列比对结果，采用生物信息学软件primer5.0设计一对引物，引物命名为F1，F2。引物由宝生物工程有限公司合成。

F15'AGGCTAGCCATGCCCTTAGTAG 3'，F25'TGTGCCATGTACAGCAGAGATT 3'。

1.5 RT-PCR及产物检测

应用Trizol试剂盒稍加改动提取方法，提取腹泻粪便及标准毒株的总RNA，以Random 6 mers为随机引物，按照RT-PCR试剂盒书进行cDNA合成，产物作为cDNA为模板，以F1、F2作为引物进行PCR的扩增。PCR扩增反应体系为：10*PCR Buffer Ⅱ5ul， DNTP Mixture 2ul， F11.0ul， F2， 1.0ul，TaRaPa ExTaqTMHS，0.5ul，cDNA模板5ul，灭菌超纯水 up to 50ul。扩增条件：PCR扩增条件为：94℃1min，94℃30s，56℃30s， 72℃30s， 总计 40 个循环， 72℃10min。 取 5μlPCR产物以5V/cm的恒定电压于10g/L的琼脂糖凝胶中电泳。

1.6 PCR产物的纯化及测序

采用天根公司微量胶回收试剂盒纯化PCR预期产物，纯化产物送至生物工程 (上海）股份有限公司测序。

2 结果

电泳结果显示，在PCR扩增产物电泳中标准毒株及粪便提取总RNA均扩增出约280bp的条带，结果见图。将扩增出的阳性产物送至生物工程 (上海）股份有限公司测序，测序结果表明，发病犊牛的病原为BVDV，其与NCBI上所登录的BVDV序列同源性最高为98%，参见附图。

附图 BVDVPCR扩增结果

3 讨论

(1）实验室检测结果结合临床症状分析，本次祁连县养殖场的犊牦牛腹泻病是由牦牛BVDV和ETEC所致。

(2）2016年陈新诺等[8]对青藏高原地区4个省的牦牛腹泻样本进行BVDV病原流行病学调查，发现BVDV感染在青藏高原地区的牦牛中普遍存在。格松[9]对2014～2015年青海玉树地区的血清学调查资料显示，目前牛群存在BVDV较高的抗体阳性率，且已相当严重，并且有日益严重的趋势。

(3）BVDV在牛群中的潜伏感染常常导致该病很难净化。该病可以通过母牛垂直传播，感染BVDV的母牛会出现产死胎及弱仔现象，严重影响规模养牛场的发展。首先加强对新购牛的检疫，最好坚持自繁自养，对引进的犊牛一定要做好BVDV抗体检测工作，及时淘汰BVDV阳性感染牛成为该病综合防控的重要方法。血清抗体检测呈阴性方可饲养。防治BVDV最有效的手段就是牛群净化，将BVDV阳性牛逐步淘汰。同时，加强饲养管理，经常消毒，保持良好的环境卫生，经常清理养牛场的粪便，保持牛舍通风良好。该病重在预防，发病后目前主要采取对症治疗措施，及时补液防止脱水。

[1]刘亚刚,殷中琼,刘世贵,等.牦牛病毒性腹泻/粘膜病的防制研究[J].中国预防兽医学报,2003,25(6):487-490.

[2]Heinz F X,Collet M Sprucely R H,et al.Family Flavored.In“Virus Taxonomy”.Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Virus”[M].Academic press.San Diego,2000:859-878.

[3]Collet M S,Wiskerchen M,Welniak E,et al.Bovine viral diarrhea virus genomic organization[J].Arch virol Suppl,1991,3:19-27.

[4]Bartels C J,Holzhauer M,Jorritsma R,et al.Prevalence,prediction and risk factors of en-teropathogens in normal and non-normal faeces of young Dutch dairy calves[J].Preventive Veterinary Medicine,2010,93(2/3):162-169.

[5]Izzo M M,Kirkland P D,Mohler V L,et al.Prevalence of major enteric pathogens in Australian dairy calves with diarrhea[J].Australian Veterinary Journal,2011,89(5):167-173.

[6]Soltan M A,Wilkes R P,Elsheery M N,et al.Circulation of bovine viral diarrhea virus-1 （BVDV-1）in dairy cattle and buffalo farms in Ismailia province,Egypt[J].Journal of Infection in Developing Countries,2015,9(12):1331-1337.

[7]Yong-Il Cho,Won-Il Kim,Siyuan Liu,et al.De-velopment of a panel of multiplex real-time polymerase chain reaction assays for simultaneous detection of major agents causing calf diarrhea in feces[J].J.Vet.Diagn.Invest,2010,22(7):509-517.

[8]陈新诺,张朝辉,徐林,等.青藏高原牦牛感染BVDV和BEV的分子流行病学调查[J].动物医学进展,2016,37(9):35-38.

[9]格松.青海省玉树地区牛病毒性腹泻病的血清学调查[J].中国动物保健,2016,18(7):10-11.

马吉云 （1982-）男，青海省西宁市人，硕士研究生，研究方向：预防兽医学。