路德维希肠杆菌EM1对二氯喹啉酸和Cd2+复合污染的修复

徐淑霞,杜文涛,王晓雅,张继冉,赵 培,吴 坤



路德维希肠杆菌EM1对二氯喹啉酸和Cd2+复合污染的修复

徐淑霞,杜文涛,王晓雅,张继冉,赵 培,吴 坤*

(河南农业大学生命科学学院,农业部农业微生物酶工程重点实验室,河南郑州 450002)

为解决稻田水体环境中农药与重金属的复合污染问题,利用扫描电镜、傅里叶红外光谱等分析技术,研究了路德维希肠杆菌()EM1对二氯喹啉酸-Cd2+复合污染的修复机理.结果表明,EM1能在以二氯喹啉酸为单一碳源的条件下对Cd2+进行吸附.在温度为35℃,pH为6.0的条件下培养7d,EM1对50mg/L的二氯喹啉酸和Cd2+的降解及吸附率达到最大,分别为30%和60%.扫描电镜结果表明,复合修复过程中菌体形态发生变化,菌体表面分泌大量胞外聚合物.红外扫描分析显示,胁迫条件下菌体细胞壁结构并未发生变化,菌株降解二氯喹啉酸和吸附Cd2+的过程主要与菌体表面的羟基、酰胺基、糖环中的C-O-C及脂肪族化合物有关.

二氯喹啉酸；Cd；路德维希肠杆菌EM1；吸附；复合污染

复合污染是指两种或两种以上污染物存在于同一环境介质中所引起的污染.近年来,由于人类生活质量的提高和工农业的不断发展导致了不同种类的有机化合物(除草剂、塑料、单宁、多酚等)和无机化合物(镉、铜、铅、铬、汞等)进入环境并共存,形成复合污染.有机和无机化合物的复合污染是一种普遍的全球问题.多种不同污染物共存时,往往会相互作用和影响,从而改变彼此的环境行为和生态毒性[1].二氯喹啉酸作为一种特效选择性生长激素类除草剂,半衰期较长难以降解,导致此类农药在土壤及水体中大量残留[2-3],严重影响水稻等作物的产量和品质.Cd2+在电镀工业和冶金工业中应用广泛,Cd2+被人和动物吸收后,选择性地在肝脏和肾脏中蓄积,严重损伤肾小管,从而引起糖尿、蛋白尿等一系列症状[4].农药与重金属复合污染是我国水体和土壤环境中普遍存在的污染形式并对农产品安全和人体健康构成严重威胁.因此,必须重视土壤复合污染问题,探索经济高效的复合污染修复技术,为国家粮食安全及农业的可持续发展奠定基础.

微生物修复技术由于具有对污染物降解彻底、无二次污染、费用低、绿色环保等优点正成为人们研究的热点.目前,二氯喹啉酸和重金属Cd2+在环境中的残留与安全性逐渐被人们所重视,但对其残留毒害的研究和处理还处于探索阶段,相关报道较少.范俊等[5]在长期施用二氯喹啉酸的土壤中分离筛选出了一株细菌QC06,并确定了该菌株在二氯喹啉酸浓度为50mg/L、pH 7.0、温度30℃的最佳降解条件下,培养至第7d对二氯喹啉酸的降解率可达95.31%; Polti等[6]则分离出五株能够同时去除重金属Cd2+和农药林丹的放线菌,其中放线菌M7对两种污染物的去除率都较高,达40%左右; Olaniran[7]调查了铅和汞的存在下微生物对1,2-二氯乙烷在土壤中降解产生负面的影响,并发现生物刺激对1,2-二氯乙烷微生物降解产生积极的影响.

目前,国内外对有机污染物和重金属单一污染的研究较多,而针对水体中二氯喹啉酸和重金属Cd2+复合污染生物修复方面的研究报道还比较少.本研究以实验室前期分离的路德维希肠杆菌()EM1为出发菌株,该菌在降解二氯喹啉酸的同时高效吸附重金属Cd2+,研究EM1降解二氯喹啉酸和吸附重金属Cd2+的最佳条件以及机理,以期为除草剂和重金属复合污染的生物修复实践提供理论依据和技术支持.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌株 路德维希肠杆菌EM1,由实验室分离筛选得到.

无机盐培养基(g/L):K2HPO41.0,NaH2PO41.0,CaCl2×H2O 0.02,MgSO4×7H2O 0.2,NH4NO31.0, FeCl3×3H2O 0.05,pH 7.0.

LB培养基(g/L):NaCl 10.0,胰蛋白胨10.0,酵母浸粉5.0,pH值7.0.

1.1.2 试验仪器 2695型高效液相色谱仪,美国waters公司;原子吸收分光光度计,日本HITACHI Co公司;JSM.6490LV扫描电子显微镜,德国Hettick公司;VERTEX70傅里叶变换红外光谱,美国waters公司.

1.2 实验方法

1.2.1 温度对EM1吸附Cd2+及降解二氯喹啉酸的影响 实验分别在两组装有50mL无机盐培养基的250mL锥形瓶中进行,分别添加二氯喹啉酸、CdCl2,使其初始浓度均为50mg/L(含Cd2+培养基中添加0.1%的葡萄糖作为碳源),调pH值为7.0,接种处于对数期的菌种,分别于25℃、30℃、35℃、40℃和45℃条件下振荡培养7d.高效液相色谱、原子吸法分别测定溶液中二氯喹啉酸和Cd2+的浓度,确定菌株EM1吸附Cd2+及降解二氯喹啉酸的最佳温度.

1.2.2 pH值对EM1吸附Cd2+及降解二氯喹啉酸的影响 在装有50mL无机盐培养基的250mL锥形瓶中分别添加二氯喹啉酸、CdCl2,使其初始浓度均为50mg/L(含Cd2+培养基中添加0.1%的葡萄糖作为碳源),调pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,接种处于对数期的菌种,35℃条件下,振荡培养7d,测定二氯喹啉酸和Cd2+的浓度,确定EM1吸附Cd2+及降解二氯喹啉酸的最佳pH值.

1.2.3 EM1对不同浓度Cd2+及二氯喹啉酸复合污染的降解 在装有50mL无机盐培养基的250mL锥形瓶中添加二氯喹啉酸和CdCl2,Cd2+的初始浓度均为50mg/L,二氯喹啉酸初始浓度分别为50,100,200mg/L,调pH值为7.0,35℃条件下振荡培养12d,每天取样,测定溶液中二氯喹啉酸和Cd2+的浓度.

1.2.4 EM1对二氯喹啉酸-Cd2+复合污染的解吸 复合修复实验在含有50mg/L二氯喹啉酸的无机盐培养基中进行,实验组中Cd2+的初始浓度分别为50,100,200mg/L, 35℃条件下振荡培养7d,每天取样一次.以添加0.1%葡萄糖但不添加CdCl2的无机盐培养基作为对照.

1.2.5 扫描电镜分析 分别取于二氯喹啉酸初始浓度均为50mg/L,Cd2+的初始浓度分别为50,100,200mg/L的无机盐培养基中,35℃条件下振荡培养7d的菌悬液(以在不添加任何试剂的无机盐培养基中生长的菌体作空白对照),离心(8000r/min,5min)后加入新鲜的2.5%戊二醛溶液固定2~4h[8].固定后的菌体离心(8000r/min,5min),弃上清,磷酸缓冲液清洗3次,乙醇梯度脱水, 30%、50%、70%、85%、95%各一次,100%乙醇脱水2次,每次10~20min.乙酸异戊酯置换2次,每次20min.处理后的菌体干燥,喷金.

1.2.6 红外光谱分析 取于二氯喹啉酸初始浓度均为50mg/L,Cd2+的初始浓度分别为50、100、200mg/L的无机盐培养基中, 35℃条件下振荡培养7d的菌悬液(以在不添加任何试剂的无机盐培养基中生长的菌体作空白对照),菌体离心干燥后与KBr粉末混和均匀研磨成细粉[9],细粉填入压片模具在压片机中压制成透明薄片,于FTIR样品仓进行测定.

1.3 检测方法

二氯喹啉酸浓度的测定:样品离心(10000r/ min,15min,4℃)后,上清液经0.45μm滤膜过滤,HPLC色谱检测.HPLC色谱条件:50mm× 4.0mm,5μm,C18柱,流动相为(甲醇):(1%冰乙酸)=60:40,流速1mL/min,检测波长240nm,柱温35℃.

Cd2+浓度的测定:样品离心(10000r/min, 15min,4℃),上清经2%的稀硝酸稀释定容后,利用原子吸收分析仪检测.

2 结果与讨论

2.1 温度对EM1吸附Cd2+及降解二氯喹啉酸性能的影响

温度是微生物在生长代谢过程中最基本的环境因素.图1显示在温度为25~45℃的范围内,菌株EM1均可对Cd2+及二氯喹啉酸进行不同程度的吸附和降解,且随着温度的升高,吸附率和降解率也随之增大.当温度为35℃时,吸附率和降解率达到最大,分别为90%和41%.温度在菌体吸附重金属离子时起到很重要的作用,温度会影响细胞壁的稳定性及结合位点表面官能团的电离,从而影响微生物吸附重金属的过程[10].随着温度的升高,当温度为45℃时吸附率则下降为30%,这表明温度升高条件下,细菌细胞壁表面结构基团的变化及金属结合位点活性的降低,可能是导致吸附率下降的原因.同样在菌株EM1 对二氯喹啉酸的降解过程中,随着温度的升高,二氯喹啉酸的降解率也出现明显的下降趋势,当温度为45℃时,降解率仅为12%.以上结果表明,菌体吸附Cd2+和降解二氯喹啉酸的最适温度为35℃.

2.2 pH值对EM1吸附Cd2+及降解二氯喹啉酸性能的影响

微生物在生长过程中需要适宜的pH值范围,pH值过高或过低均会影响菌体的生长.图2结果表明,pH值对菌体吸附Cd2+和降解二氯喹啉酸的影响较大,酸性和碱性的条件均会降低菌体对Cd2+的吸附率和二氯喹啉酸的降解率.在重金属被吸附的过程中氢离子浓度是一个重要的因素,生物吸附能力取决于生物量的多少及菌体表面所带电荷可与金属离子位点结合的多少[11].当溶液体系中pH值较低时,H+浓度较高,从而形成大量的H3O+占据菌体表面大多数的金属结合位点,抑制Cd2+与相关基团的结合,进而导致吸附率降低.随着pH值的升高.当pH值为6.0时,生物质表面官能团的离解度增加,静电相互作用增强,生物质表面的负电荷也随之增多,因此促进了对带正电的Cd2+的富集.随着pH值的进一步升高,当pH值为9.0时,Cd2+的富集率降低为43%,这可能是由于pH值偏碱性时,Cd2+与溶液中的OH-形成沉淀,进而导致Cd2+吸附率的降低.而在菌株EM1对二氯喹啉酸的降解过程中,pH值同样可以通过改变细胞质膜的透性、膜结构的稳定性及电离性影响菌体细胞对营养物质的吸收,从而影响微生物的生长速率及酶的活性,进而影响菌株EM1对二氯喹啉酸的降解.综上,菌株EM1的生长适合偏酸性的环境,对Cd2+吸附和二氯喹啉酸降解的最适pH值分别为6.0和7.0.

2.3 菌株EM1对不同浓度Cd2+的吸附及二氯喹啉酸的降解

任何一种具有去除污染物能力的微生物都会对相应的污染物表现出一定的耐受能力.图3显示,在不同浓度条件下,菌体培养到第7d时,对Cd2+的吸附率和二氯喹啉酸的降解率均达到最大.当Cd2+初始浓度为50mg/L时,菌株EM1对重金属Cd2+的吸附效果最好,吸附率为90%.当Cd2+浓度逐渐增大时,吸附效果缓慢下降,可能是高浓度的Cd2+对菌株EM1产生毒害作用,逐渐抑制其生长,从而影响重金属Cd2+的吸附.重金属吸附率的高低还与细菌的吸附位点及饱和度有关.当Cd2+的初始浓度较低时,微生物的吸附位点未达到饱和,去除率较高.随着Cd2+浓度的增加,吸附逐渐达到饱和,导致去除率降低.对于二氯喹啉酸的降解,当二氯喹啉酸初始浓度为50mg/L时,菌株EM1对二氯喹啉酸的降解效果最好,降解率为40%.当二氯喹啉酸浓度增大时,降解效果下降,可能是高浓度的二氯喹啉酸对菌体产生毒害作用,抑制其生长,从而影响二氯喹啉酸的降解.以上结果表明,菌株EM1对Cd2+和二氯喹啉酸均表现出一定的耐受能力,且对两种污染物的最适耐受浓度均为50mg/L,较高的Cd2+和二氯喹啉酸浓度会导致菌体蛋白质变性,降低细菌体内与生长代谢有关的酶活性,从而抑制菌体的生长和代谢,影响细菌的生长.

2.4 复合修复时EM1对二氯喹啉酸的降解和Cd2+的吸附

复合修复结果如图4和图5所示.当二氯喹啉酸和Cd2+初始浓度均为50mg/L时, EM1对二氯喹啉酸和Cd2+的降解和吸附效果最好,分别为30%和60%.当二氯喹啉酸浓度保持不变,Cd2+浓度逐渐增大时, EM1对二氯喹啉酸的降解和Cd2+的吸附效果缓慢下降.Cd2+浓度为100mg/L时,EM1对二氯喹啉酸和Cd2+的降解和吸附率分别为30%和42%.Cd2+浓度为200mg/L时,降解和吸附率分别为6%和10%.这可能是由于胁迫作用的增强,高浓度的Cd2+对菌株EM1产生毒害作用,逐渐抑制其生长,也可能是二氯喹啉酸和Cd2+复合污染对细菌的生长代谢产生协同抑制作用,从而对二氯喹啉酸的降解和Cd2+的吸附产生较大的影响.复合修复实验结果表明, EM1能在以二氯喹啉酸为单一碳源的条件下对Cd2+进行吸附,进而达到复合修复的效果.

2.5 EM1复合修复前后的形态变化

二氯喹啉酸和Cd2+同时存在时,EM1的降解和吸附前后菌体电镜扫描结果如图6所示.图6a为对照组,6b、6c、6d中二氯喹啉酸的浓度为50mg/L,Cd2+的浓度分别为50,100,200mg/L.

从图6a对照组可以看出,菌体呈短杆状,细胞形态规则,表面饱满,胞外无明显的分泌物.在二氯喹啉酸和Cd2+胁迫条件下,菌体细胞开始出现严重的褶皱变形(b、c、d),周围出现大量的絮状分泌物,并伴随菌体之间的成簇聚集现象.随着胁迫作用的增强,胞外分泌物增加,聚集作用更加明显.有研究表明胞外多聚物在抵抗外界重金属胁迫过程中具有重要作用,它不仅为重金属离子提供众多的结合位点,同时也是其进入细胞的一道选择性屏障[12-13].在本研究中EM1可能通过菌体表面分泌的絮状多聚物对自身形成保护屏障,进而阻止外界有毒物质尤其是重金属离子的进入,从而缓解复合胁迫引起的毒性损伤,保证菌体存活.因此推测,图6中出现的絮状或片状分泌物为EM1降解二氯喹啉酸和吸附Cd2+时产生的有机分泌物(多糖、胞外酶或少量蛋白质).

a: 对照; b:50mg/L的二氯喹啉酸+50mg/L的 Cd2+;c: 50mg/L的二氯喹啉酸+100mg/L的 Cd2+;d:50mg/L的二氯喹啉酸+ 200mg/L的Cd2+

2.6 复合修复前后EM1的红外光谱分析

红外吸收光谱主要是由于分子的振动及转动能级跃迁产生的吸收,而分子的振动和转动决定于分子的原子组成、空间分布及化学键性质等分子结构与组成的特征.利用物质对红外光的吸收可对待测物进行定性、定量及结构的分析,因此通过傅里叶红外光谱能够识别细菌吸附重金属前后细菌细胞壁主要官能团的变化[14].常用的红外光谱的范围主要在波数为4000~400cm-1的中红外光谱区,该区域主要能级跃迁类型为分子中基团振动和分子转动,大多数有机物和无机物的化学键的基频吸收均在此谱区内,是有机物结构及定性分析应用较多的区域.

红外光谱图如图7所示.光谱图显示菌体所含组分复杂,在4000~400cm-1范围内均有吸收. 4000~2500cm-1区域主要为 X—H含氢基团的伸缩振动.图中,在3600~3200cm-1范围内出现较宽的吸收带并于3432cm-1处有最大吸收峰,该宽峰来自于O—H的伸缩振动,主要由菌体中的糖类、脂肪酸等组分贡献[15].复合修复后3432cm-1处的羟基峰出现大约10cm-1的红移且锋型宽化,吸收强度增强,这表明部分羟基参与了Cd2+的吸附过程,使O—H键长增加,振动峰红移.2927与2959cm-1处的峰分别来自于有机物中的—CH3、—CH2基团,是比较典型的脂碳链中C—H键的伸缩振动吸收带,该峰的出现能够直观的反映出菌体细胞壁及细胞膜组分中亲水及亲脂物质的信息[16];2400~2100cm-1为叁键和累积双键区,主要包括C≡C、C≡N、C=C=C、O=C=O键的伸缩振动,与其它区域相比实验组在该范围内有明显的新峰出现,而本研究中菌体所利用的碳源,二氯喹啉酸是一类具有芳香性的杂环化合物其开环产物的基团振动形式与该区域基团频率区的吸收谱带相符,因此推测该处新峰的出现可能与吸附在菌体表面的二氯喹啉酸的分解代谢产物有关;1500~400cm-1区域主要为C—C,C—O,C—N, C—X等(碳水化合物、蛋白质和脂类)伸缩振动和含氢基团的弯曲振动;1648cm-1处的吸收峰来自酰胺Ⅰ带,是C=O的伸缩振动;1542cm-1处的峰谱为酰胺Ⅱ带,是C—N的伸缩振动与N—H的弯曲振动[17];1396cm-1处的峰则为酰胺Ⅲ带,是N—H的弯曲振动和C—N的伸缩振动引起的,可能还有羧基C—O的伸缩振动及P=O、C=S的伸缩振动的贡献,其中酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带的谱峰为蛋白质的特征性峰带[18]; 1238cm-1处的峰主要由C=S、S=O、P=O等重原子的双键伸缩振动引起;1066cm-1处的峰为糖类的特征峰,吸收峰由糖环的C—O—C伸缩振动引起[19].当Cd2+的浓度增大时该处的峰型宽化,尖而窄且强度增强.电镜结果显示随着Cd2+浓度的升高,胞外分泌物增加,由此可知胁迫过程中菌体胞外分泌大量的多糖类物质参与重金属的吸附过程从而达到复合修复的目的;615cm-1处的峰来自脂肪族化合物[20],由C—Cl、C—Br和C—I的伸缩振动引起,红外光谱图显示随着胁迫作用的增强该处峰的吸收强度也随之增强且锋型锐化表明脂肪族化合物也参与了菌体的复合修复.

图7 EM1对二氯喹啉酸和Cd2+复合修复前后的红外光谱

Fig.7 FTIR spectra of the strain EM1grow in quinclorac and heavy metal Cd2+before and after the restoration

a:对照; b:50mg/L二氯喹啉酸+50mg/L Cd2+;c: 50mg/L二氯喹啉酸+100mg/L Cd2+;d: 50mg/L二氯喹啉酸+200mg/L Cd2+

通过对红外光谱图的分析可知,复合体系除在2400~2100cm-1的叁键和累积双键区有明显的新峰出现外,实验组的红外光谱峰形基本一致,一些特征峰只在部分波段吸收位置和强度发生了变化(3432、1648、1542、1066及615cm-1处发生红移)出现波峰强弱的区别.以上结果表明: EM1在降解二氯喹啉酸和吸附Cd2+的复合修复过程中菌体表面的羟基、酰胺基、糖环中的C-O-C及脂肪族化合物是吸附、螯合或络合金属离子的主要活性基团.

3 结论

3.1 EM1能够以二氯喹啉酸为唯一碳源,且对Cd2+进行吸附.对Cd2+吸附和二氯喹啉酸降解的最适温度为35℃,最适pH值分别为6.0和7.0.单一污染条件下EM1对50mg/L Cd2+及二氯喹啉酸的吸附率和降解率最高分别为92%和41%.复合修复时,当二氯喹啉酸的初始浓度为50mg/L,重金属Cd2+的初始浓度分别为50、100、200mg/L时, EM1对Cd2+和二氯喹啉酸的吸附率和降解率分别为60%和30%,42%和30%,10%和6%.

3.2 扫描电镜结果显示,对照组中菌株EM1呈短杆状,表面光滑,菌体分散,个体形态明显,细胞间无胞外物质相连.复合修复过程中菌体形态差异明显,菌体周边产生大量的胞外分泌物,并伴随着严重的集聚现象.

3.3 红外光谱图的分析结果表明,菌株EM1降解二氯喹啉酸和吸附Cd2+后,细胞成分及整体结构并未发生变化,红外光谱图的峰型基本保持一致,只是一些特征峰的吸收位置和强度发生了变化,参与吸附作用的为菌株EM1表面的羟基,酰胺基,糖环中的C—O—C及脂肪族化合物.

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Bioremediation of the combined pollution of quinclorac and Cd2+byEM1.

XU Shu-xia, DU Wen-tao, WANG Xiao-ya, ZHANG Ji-ran, ZHAO Pei, WU Kun*

(Key Laboratory of Enzyme Engineering, College of life sciences, Henan Agricultural University, Zhengzou 450002, China)., 2017,37(8)：3159~3165

Basing on the study of degradation and adsorption characteristics of quinclorac and cadmium, bacteria EM1 was used as the test strain. The interaction mechanism of quinclorac-Cd2+combined pollution withEM1was investigated by using SEM and FTIR analytical techniques. The experimental results showed that the strains could adsorb Cd2+with quinclorac as the sole carbon source. After 7d culture at a temperature of 35℃, pH 6.0, the degradation and adsorption of quinclorac and Cd2+in 50mg/L reached the maximum, which were 30% and 60% respectively. The SEM results showed that in the process of composite repair the morphology of the cells was changed and a large number of extracellular polymeric substances were secreted in the cell surface. Infrared scanning analysis showed that the changes had not taken place in the cell walls under the stress condition. Hydroxy, aminoacyl, carbon-oxygen- carbon bond in the sugar ring and the aliphatic compounds were confirmed to be the key functional groups for the strain to biodegrade quinclorac and adsorb Cd2+.

quinclorac；Cd；EM1；biosorption；combined pollution

X172

A

1000-6923(2017)08-3159-07

徐淑霞(1971-),女,河南灵宝人,副教授,博士,主要从事环境污染物的微生物转化和修复研究.发表论文42篇.

2016-12-21

河南省重点科技攻关项目(152102110054);河南省高等学校重点科研项目(15A180005);河南省高校科技创新团队支持计划(15IRTSTHN014)

* 责任作者, 教授, wukun63@126.com