反式雄烯二酮对食蚊鱼的生长发育和第二性征的影响

古明宗 曾科 杨华杰 方贵桢 侯丽萍

摘 要：为了研究反式雄烯二酮（ADD）长期暴露对食蚊鱼（Gambusia affinis）生长发育和第二性征的影响，分别用不同浓度的ADD（50、200、500、2 000 μg/L）对食蚊鱼进行60 d的水浴暴露处理，以0.1%甲醇和清水作对照，考察食蚊鱼形态特征、组织结构以及生长和生殖相互关系的变化情况。结果表明：雌性食蚊鱼的各项生理指标均受水体中雄性激素ADD的影响，且影响程度随着ADD浓度的增加而增加。随着雄性激素ADD的加入，食蚊鱼的体长和臀鳍长变短，体重、性腺重和肝重变轻，卵子数量变少；卵细胞发生了形变、肿胀，甚至退化；肝细胞的细胞核偏移中央，细胞肿大，出现了空泡结构，细胞脂质化程度逐渐加深；鳃丝长短不一，排列不整齐，甚至出现了退化现象；臀鳍出现上短下长，尖端分叉的现象。总体来讲，水体中雄性激素ADD会引发雌性食蚊鱼出现雄性化的第二性征。

关键词：雄激素；反式雄烯二酮（ADD）；食蚊鱼；生长发育

中图分类号：S949 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2017）01-0063-05

Abstract： In order to study the trans androstenedione （ADD） long exposure to Gambusia affinis growth and the influence of the secondary sex characteristic， with different concentrations of the ADD （50， 200， 500， 2 000 g/L） to 60 d water bath exposed mosquito fish processing， 0.1% methanol and water as contrast， Gambusia affinis morphological characteristics， organization structure and the relationship between growth and reproduction was studied. The results showed that the female Gambusia affinis of various physiological indexes under the influence of male hormones in the water， ADD， and influence degree increase with the increased concentration of the ADD. As the male hormone ADD to join， the Gambusia affiniss body length and anal fin length shorter， lighter weight， gonad weight and liver weight， less number of eggs； the egg deformation happened， swelling， or even degradation； the central nucleus of liver cell migration， cell swelling， a cavity structure， degree of cell lipid change gradually deepened； the gill filament length is differ， untidy， even the degradation phenomenon appeared； the anal fin on next short length， cutting-edge forked phenomenon. In general， male hormones in the water， ADD cause female Gambusia affinis appear male secondary sex characteristic.

Key words： androgen； trans-androstenedione； Gambusia affinis； growing development

内分泌干扰物（EDCs），也称为环境激素，是一种干扰内分泌系统的外源性化学物质。这类物质在环境中即使数量极少，也能干扰人类或动物内分泌系统诸环节并导致异常效应，进而影响生物的生长发育及生殖[1]。近年来，很多国家和地区陆续在城市水环境中检测到雄激素物质。这些环境雄激素可损害水生生物正常的内分泌系统，使雌鱼出现雄性第二性征，一方面导致雌性水生生物生殖能力下降，另一方面引起某些水生生物雌雄比例发生改变[2-4]。反式雄烯二酮就是这样一种雄激素，它广泛存在于地表水中，但目前尚未有与其相关的毒理数据。

食蚊鱼（Gambusia affinis）是原产于北美洲的著名入侵种，属鳉形目胎鳉科，广泛分布在我国华南地区的淡水水体中，容易捕捞，也易于在实验室饲养。因此，食蚊鱼被当作模式生物广泛用于化合物的各种毒性测试，是研究内分泌干扰作用和水体污染监测的理想指示生物[5]。

为进一步探讨反式雄烯二酮的环境毒理效应，筛选出相应的生物标志物，研究以食蚊鱼为对象，探讨了反式雄烯二酮长期暴露对其生理活动及生长发育的影响。

1 材料与方法

1.1 試验材料

供试食蚊鱼购自广州花鸟鱼虫市场，供试试剂为反式雄烯二酮母液（ADD，分析纯）和甲醇（分析纯）。

1.2 暴露处理

挑选大小相似的雌性食蚊鱼210条，分6个鱼缸分别编号1～6，每个鱼缸35条，培养1个月，让雌鱼适应该鱼群密度。暴露处理：编号1～4的鱼缸中分别添加反式雄烯二酮50、200、500和2000 μg/L；5号鱼缸为药剂对照组，加入0.01%甲醇；6号鱼缸为空白对照组，不加药剂。暴露試验开始后，隔天换1/2体积的水，换水后添加适当的反式雄烯二酮使水中浓度保持一致，培养2个月[6]。

1.3 测定指标及方法

从形态学观测记录食蚊鱼各生长指标，从毒理学方面观测各组织切片中细胞和结构的变化。

1.3.1 形态学和生理学测定 暴露结束后，将食蚊鱼埋入冰中致死。从低浓度开始测量观察，测量每条食蚊鱼的体长、体重和臀鳍数。对食蚊鱼进行解剖，迅速取出鱼肝、鱼鳃及性腺，用滤纸吸取血渍，称重记录。

1.3.2 组织切片制作 配置Bouin氏液：称取2.25 g苦味酸固体溶解于150 mL蒸馏水中，福尔马林50 mL，冰醋酸10 mL，搅拌均匀。用Bouin氏液迅速固定称重之后的鱼肝、鱼鳃及性腺，封盖并贴标签。用浓度梯度递增的乙醇溶液脱水，至100%乙醇，使脱水硬化，选用二甲苯（xylene）为透明剂。用石蜡作为支持介质并对组织进行石蜡包埋，用切片机切片后，采用苏木素伊红染色法（EH染色法）进行染色，后用树胶和盖玻片封固。

1.3.3 骨骼制作 将剩下的食蚊鱼放置浓度为2%～3%的氢氧化钾中浸泡12 h，在体式显微镜下，剔除鱼身上的皮肉，再用1%的茜素红染色30 min，用清水洗涤，放置体式显微镜下观察，记录臀鳍的变化特征。

1.3.4 肝体指数（HSI）和性体指数（GSI） HSI=（肝重/鱼体重量）×100%，GSI=（性腺重/鱼体重量）×100%。

1.4 数据分析

试验所得数据均用SPSS17.0软件进行分析，采用单因素方差分析（ANOVA）法来检验不同处理下食蚊鱼各生理指标的差异，并用LSD对结果进行多重比较。如果P<0.05，则认为处理间差异显著。

2 结果与分析

2.1 水体中ADD暴露对雌性食蚊鱼形态特征的影响

2.1.1 体 长 由图1可知，当水体中ADD浓度为500和2 000 μg/L时，雌性食蚊鱼的体长极显著短于其他处理，而浓度为50和200 μg/L时，雌性食蚊鱼的体长与对照组差异不显著。因此，可认为雌性食蚊鱼在含有500和2 000 μg/LADD的水体中，体长发生了特变。

2.1.2 臀鳍长 由图2可知，当水体中ADD浓度为500和2 000 μg/L时，雌性食蚊鱼的臀鳍长极显著性短于对照组，而浓度为50和200 μg/L时，雌性食蚊鱼的臀鳍长与对照组差异不显著。因此，可认为ADD对雌性食蚊鱼臀鳍的生长发育有显著影响，但在高浓度下才出现明显突变。

2.1.3 体 重 由图3可知，当水体中ADD浓度为500和2 000 μg/L时，雌性食蚊鱼的体重极显著性轻于对照，而浓度为50和200 μg/L时，雌性食蚊鱼的体重与对照组差异不明显。因此，可认为雌性食蚊鱼在含有500和2 000 μg/LADD的水体中，体重发生了特变；而在50和200 μg/L的ADD条件下，体重与对照组差异不显著，并未发生特变。

2.1.4 性腺重 由图4可知，当水体中ADD浓度为500和2 000 μg/L时，雌性食蚊鱼的性腺重极显著性轻于对照，而在浓度为50和200 μg/L时，雌性食蚊鱼的性腺重与对照组差异不明显。这表明ADD对雌性食蚊鱼性腺的生长发育有极显著的抑制作用，但只表现在高浓度下。

2.1.5 肝 重 由图5可知，当水体中ADD浓度为500和2 000 μg/L时，雌性食蚊鱼的肝脏重极显著性轻于对照，而在浓度为50和200 μg/L时，雌性食蚊鱼的肝脏重与对照组差异不明显，这表明高浓度ADD对雌性食蚊鱼肝脏生长发育有极显著的抑制作用，而在低浓度下无抑制作用。

2.1.6 卵 子 由图6可知，当水体中ADD浓度为500和2 000 μg/L时，雌性食蚊鱼的卵子数量极显著少于对照，而当浓度为50和200 μg/L時，雌性食蚊鱼的卵子数量稍低于对照，但差异不显著。因此，可认为高浓度的ADD条件下，雌性食蚊鱼的卵子数量发生了特变，而低浓度的ADD对雌性食蚊鱼卵子数量的影响不显著。

2.2 水体中ADD暴露对雌性食蚊鱼各组织结构的影响

2.2.1 性 腺 卵母细胞的发育可分为6个时期，分别为：I时期，卵原细胞时相；II时期，初级卵母细胞；III时期，卵黄泡出现时期；IV时期，卵黄充满时相；V时期，成熟卵细胞时相；VI时期，退化吸收时期。图7中A和B分别为空白对照和药剂对照的食蚊鱼的性腺，为正常状态下的卵母细胞，包含了I～VI个时期；图8中C～F为卵黄充满时期（IV时期），可以看出卵细胞发生了形变、肿胀，甚至出现了退化的卵母细胞，表明在50～2 000 μg/L的ADD作用下，食蚊鱼卵细胞发育出现了阻碍和抑制。正常环境中的鱼类通过下丘脑分泌促性腺激素释放激素（GnRH），刺激促性腺激素的分泌，然后促性腺激素促进雌激素的分泌，从而促使性腺发育。该试验结果显示，食蚊鱼的性腺发育受到ADD的抑制，而且随着ADD浓度的增加，抑制作用越强。这可能与食蚊鱼雌激素的分泌受到抑制或者是与食蚊鱼性腺发育有关的激素分泌受到抑制有关。

2.2.2 肝 由图8A和图8B可知，正常情况下，食蚊鱼的肝细胞排列紧密，细胞质均匀，细胞核位于细胞中心。但水体中加入了ADD之后，从图8C～F可以看出，肝细胞的细胞核偏移中央，细胞肿大，出现了空泡结构，细胞脂质化程度逐渐加深。其中，图8E和图8F的空泡结构较多，肝细胞肿大更严重。由此可知，ADD对雌性食蚊鱼肝脏的毒害作用较为严重。

2.2.3 鰓 正常情况下，食蚊鱼的鳃丝排列紧密，整齐，细长均匀，如图9A～B所示。当水体中出现ADD以后，食蚊鱼的鳃丝发生了变化，表现为鳃丝长短不一，排列不整齐，甚至出现了退化现象；且随着ADD浓度的增加，病变程度越严重，如图9C～F。鳃是鱼类的重要呼吸器官，鱼体与外环境的气体交换主要由鳃来完成。当水体中存在ADD时，鱼鳃直接暴露于ADD污染下，受其毒害作用而发生病变，而鳃发生病变必然会影响鱼类的正常代谢和生长；情况严重时，鳃的气体的交换量（即呼出二氧化碳，吸收水中氧气）不能维持最低生命活动需要，鱼类就会窒息死亡。

2.2.4 臀 鳍 如图10A所示，正常情况下雌性食蚊鱼的臀鳍长度整齐，鳍条尖端分叉少。水体中加入ADD后，食蚊鱼的臀鳍出现上短下长，尖端分叉的现象（图10B）。这表明在ADD的作用下，雌性食蚊鱼的臀鳍有雄性化延长的趋势。

2.3 水体中ADD暴露对雌性食蚊鱼生长与生殖相互关系的影响

鱼类的生长包括营养生长和生殖生长，肝体指数（HSI）和性体指数（GSI）的变化可以反映出生长与生殖的相互关系，也可以反映卵黄的发生和积累过程。鱼类卵黄的发生主要通过两种形式：一是由卵母细胞自身合成，称为内源性卵黄合成或自动合成；二是自卵母细胞以外的地方合成，然后进入卵母细胞，称为外源性卵黄合成。外源性卵黄的形成是在雌激素作用下，肝细胞中首先合成卵黄前体物质（卵黄蛋白原），然后经血液循环运输到卵巢，再通过微胞饮作用被卵母细胞吸收，最终在卵母细胞中裂解为卵黄蛋白，作为卵母细胞发育与成熟的物质基础。由图11～12可以看出，各处理食蚊鱼的HSI与GSI的变化趋势相同，HIS和GSI均随ADD浓度的增加而不断降低。这说明在ADD作用下，雌性食蚊鱼卵巢的生理功能受到抑制而无法吸收或无法分解由肝细胞合成的卵黄蛋白原，或卵黄蛋白原的输送受到抑制。

综上所述，在ADD作用下，雌性食蚊鱼的HSI与GSI具有正相关的效应，营养生长与生殖生长均受ADD抑制。

3 结 论

试验结果表明，雌性食蚊鱼的各项生理指标均受水体中雄性激素ADD的影响，且影响程度随着ADD浓度的增加而增加。从形态特征来看，随着雄性激素ADD的加入，食蚊鱼的体长和臀鳍长变短，体重、性腺重和肝重变轻，卵子数量变少。从组织结构来看，随着雄性激素ADD的加入，卵细胞发生了形变、肿胀，甚至退化；肝细胞的细胞核偏移中央，细胞肿大，出现了空泡结构，细胞脂质化程度逐渐加深；鳃丝长短不一，排列不整齐，甚至出现了退化现象；臀鳍出现上短下长，尖端分叉的现象。从生长与生殖的相互关系来看，HIS和GSI均随ADD浓度的增加而不断降低。总体来讲，水体中雄性激素ADD会引发雌性食蚊鱼出现雄性化的第二性征。

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[6]侯麗萍，舒 琥，李海鵬，等. 雄烯二酮长期暴露对食蚊鱼肝脏生物转化酶系的影响[J]. 环境化学，2015，34（3）：442-447.

（责任编辑：成 平）