巴西橡胶树ADP 核糖基化因子的鸟核苷酸交换因子基因(HbGNOM)的鉴定与表达

郑昕宇，王倩男，罗红丽

(海南大学 热带农林学院，海南省热带生物资源可持续利用重点实验室，海南 海口 570228)

巴西橡胶树ADP核糖基化因子的鸟核苷酸交换因子基因(HbGNOM)的鉴定与表达

郑昕宇，王倩男，罗红丽

(海南大学 热带农林学院，海南省热带生物资源可持续利用重点实验室，海南 海口 570228)

在橡胶树转录组测序的基础上，通过RT-PCR技术扩增得到了橡胶树的一个ADP 核糖基化因子的鸟核苷酸交换因子基因(HbGNOM)，该基因包含了一个4 410 bp的开放阅读框，编码了一个含1 470个氨基酸的蛋白.生物信息学的分析结果表明：橡胶树HbGNOM蛋白与麻风树、木薯、蓖麻和拟南芥的GNOM蛋白高度相似，相似性分别为97%，96 %，95 %和84%.半定量分析的结果表明：当橡胶树受到白粉病菌侵染时，HbGNOM基因在叶片中的表达明显升高，但其对炭疽病菌的侵染不产生应答；HbGNOM基因在叶片中的表达可受植物激素乙烯(ET)的诱导，但其对水杨(SA)和茉莉酸(JA)的处理没有明显应答，因此，HbGNOM可能与乙烯信号传导途径有关，并且参与了橡胶树对白粉病的抗病反应.

巴西橡胶树； HbGNOM； 表达分析

小 G 蛋白(Small GTPase)作为一种“分子开关”在真核生物的生命活动中起着重要的作用，它调控了多种信号转导途径，并与蛋白质的分配运输、细胞骨架的形成以及细胞分化有着密不可分的关系[1-2].小G蛋白功能的发挥依赖于被称为鸟核苷酸交换因子(Guanine nucleotide exchange factors, GEFs)的附属蛋白[3]，该附属蛋白可以将小G蛋白从非活性状态转变/转换为活化状态，处于活化状态的小G蛋白能够与效应器分子作用而共同完成相应的生理功能[4].ADP 核糖基化因子(ADP-ribosylation factor, ARF)是最先报道的一种小G蛋白[5]，它的交换因子ARF-GEFs主要分布在各种生物膜系统中，它通过活化ARF来参与调控细胞内蛋白的囊泡运输和生物膜转运，进而影响生物的生长发育和对生物胁迫的抗性[1,6].

在模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)中已经鉴定了8个ARF-GEF，其首个ARF-GEF被命名为GNOM，它与人的ARF-GEF编码基因 GBF1、酵母的ARF-GEF编码基因Gea1p同源[6-7].拟南芥GNOM与植物的生长发育和生长素的正常运输密不可分[8-10]，GNOM基因的功能缺失突变体gnom胚胎畸形，胚根缺失[11].GNOM蛋白可以介导生长素极性转运载体元件 PIN1 向胞膜的运输[12].不仅如此， GNOM还能够调节植物根的向水性和向地性，但该过程与PIN介导的生长素运输途径无关[13].PEN1(PENETRATION 1)基因编码了一个突触融合蛋白(syntaxin)，参与了囊泡转运和乳突的形成，它使植物对病原菌的穿透抗性得到了提高[14].GNOM通过促进植物PEN1的运输，从而提高了植物对白粉病的抗性[15].

白粉病和炭疽病是橡胶树的重要叶部病害，它们严重影响了橡胶的产量.在前期研究中，利用RNA-Seq技术分别对橡胶树叶片受白粉病菌和炭疽病菌侵染前后的基因差异表达情况进行了分析，研究发现在白粉病菌侵染前后的橡胶树叶片中HbGNOM的cDNA序列的表达水平发生了明显变化，但在炭疽病菌侵染前后的橡胶树叶片中，其表达水平没有明显变化，故推测该基因与橡胶树对白粉病的抗性有关.在橡胶树GNOM 基因的研究尚未见报道，为此，本研究克隆了橡胶树中GNOM的同源基因HbGNOM，对其表达模式进行了初步分析，旨在为进一步研究该基因在橡胶树抗白粉病中的功能奠定基础.

1 材料与方法

1.1实验材料和菌种本研究以巴西橡胶树热研7-33-97品系嫁接的1年幼苗的浅绿期叶片为实验材料，所用的大肠杆菌菌株、橡胶树胶胞炭疽病菌菌株和橡胶树白粉病菌菌株均由本实验室提供.

1.2橡胶树叶片的总RNA的提取及cDNA的合成采用改良的CTAB-LiCl沉淀法来提取橡胶树叶片的总RNA[16]，并以橡胶树总RNA样品为模板，利用Thermo反转录试剂盒来进行反转录反应，以合成第一链cDNA.

1.3橡胶树GNOM引物设计及PCR扩增采用IlluminaHiSeqTM2000高通量测序技术对接种白粉病菌和炭疽病菌的橡胶树叶片进行转录组测序(未发表数据).在此基础上，设计了HbGNOM基因的特异性扩增引物HbGNOM-F(ATGGGTCGCTTAAAGCTGCAA)和HbGNOM-R(TTAACCCCCAGTGCCAGAAC).PCR扩增HbGNOM体系：10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5μL，dNTP mix(10 mmol·L-1)0.5 μL，HbGNOM-F(10 μmol·L-1)和HbGNOM-R(10 μmol·L-1)各1μL，cDNA模板1 μL，高保真酶(2.5 U·μL-1)0.5 μL，加ddH2O补足至25μL.PCR反应条件为：94 ℃ 4 min； 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min， 32个循环； 72 ℃延伸10 min.PCR扩增结束后，用w=1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，以凝胶回收试剂盒(Axygen)回收目的片段，并参照TransGen说明书将其与pEASY-Blunt载体连接后转化到Trans1-T1菌株，然后将菌液送到深圳华大公司进行序列测定.

1.4 HbGNOM基因的生物信息学分析根据HbGNOM编码区的测序结果，用DNAStar软件推测HbGNOM的氨基酸序列；利用ExPasy在线工具ProParam(http:// web.expasy.org/protparam/)分析HbGNOM的相对分子质量和等电点；利用HbGNOM 的氨基酸序列与GenBank中其他植物的GNOM氨基酸序列进行BLAST比对；利用GenBank的 CDD数据库预测HbGNOM的保守功能结构域；利用DNAMAN软件对不同物种的GNOM蛋白进行同源性比较；利用MAGA7.0，并采用NJ法来构建系统发育树.

1.5橡胶树的病害接种配置密度为5×105个·mL-1胶孢炭疽病菌孢子的悬浮液，将其均匀喷洒在长势一致的橡胶树浅绿色叶片上，在25 ℃保湿培养，分别于0，1，2，3，5，7 d等时间点采集样品，用液氮速冻后于-80 ℃保存，备用.

将白粉病菌分生孢子均匀撒在长势一致的橡胶树浅绿色嫩叶上，于25 ℃保湿培养，并分别于0，1，2 ，3，5，7 d等时间点采集样品，用液氮速冻后于-80 ℃保存，备用.

图1 HbGNOM 基因的cDNA 全长扩 增(M：Marker 5 000；1：HbGNOM 基因 cDNA 片段)

1.6不同信号分子对橡胶树的处理配置SA(5 mmol·L-1，φ=0.1%的乙醇)，JA(1 mmol·L-1，φ=0.1%的乙醇)，ET(10 mmol·L-1，φ=0.1%的乙醇)等溶液，分别均匀喷雾于长势一致的浅绿期橡胶树叶片上，以φ=0.1%的乙醇处理作为对照，然后分别于处理后的0，12，24，36，48，72 h等时间点采集橡胶树叶片样品，用液氮速冻后于-80 ℃保存，备用.

1.7 RT-PCR半定量分析按1.2方法提取各样品的总RNA，并合成cDNA.选用橡胶树HbActin作为内参基因，其HbActin特异性扩增引物序列为：HbActin-F(5′CAGTGGTCGTACAACTGGTAT3′)，HbActin-R(5′ATCCTCCAATCCAGACACTGT3′).PCR扩增体系：10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTP mix(10 mmol·L-1)1 μL，HbGNOM-F(10 μmol·L-1)和HbGNOM-R(10 μmol·L-1)各1μL，稀释10倍的cDNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶 0.5 μL，加ddH2O补足至25μL.扩增HbGNOM的PCR反应条件：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，28个循环；72 ℃ 延伸10 min.扩增HbActin 的PCR反应条件：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，26个循环；72 ℃延伸 10 min.

2 实验结果

2.1巴西橡胶树基因HbGNOM的克隆及生物信息学分析HbGNOM基因编码区特异性扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1.序列测定结果表明：该片段包含了一个4 410 bp的开放阅读框，编码了一个含1 469个氨基酸的多肽(图2).该蛋白的等电点为4.79，分子质量为364.57 KD，属于大型的ARF-GEF酸性蛋白.

图2 橡胶树HbGNOM的cDNA全长核苷酸序列及其ORF推测的氨基酸序列(图中阴影部分为Sec7保守结构域)

在GenBank的CDD数据库中进行搜索时发现，HbGNOM蛋白的565-748氨基酸区段为Sec7保守结构域(图2).利用HbGNOM蛋白的全长氨基酸序列在GenBank数据库中进行BLAST比对时发现，HbGNOM与麻风树(Jatrophacurcas, XP_012067704)、木薯(Manihotesculenta,OAY_59447)、蓖麻(Ricinuscommunis, XP_002522485)以及拟南芥(Arabidopsisthaliana,NP_172851)的GNOM蛋白的相似性分别为97%，96 %，95 %和84%，其中，Sec7保守结构域高度同源(图3).

图3 橡胶树HbGNOM 与其它植物中的GNOM 氨基酸的Sec7 保守结构域保守序列的比对结果

图4 拟南芥ARF-GEF 家族成员及不同植物中GNOM 同源蛋白的系统进化分析

为了分析橡胶树HbGNOM与拟南芥ARF-GEF成员以及与其他植物GNOM蛋白的亲缘关系，利用邻接法对拟南芥的ARF-GEF成员：AtGNOM(NP_172851)、AtGNL1(NP_198766)、AtGNL2(NP_1974621)、BIG1 (NP_195533)、BIG2 (NP_191645)、BIG3 (NP_171698) 、BIG4 (NP_195264) 和BIG5 (NP_001327198)，3个相同科属的大戟科植物的GNOM蛋白(Jatrophacurcas，XP_012067704；Ricinuscommunis, XP_002522485;Manihotesculenta, OAY59447)，6个不同科属的木本植物的GNOM蛋白(Citrussinensis, XP_006483104;Theobromacacao, XP_007045997;Vitisvinifera, XP_010663244;Gossypiumarboreum, XP_017641649;Juglansregia, XP_018821790;Eucalyptusgrandis, XP_010044471)，3个草本植物的GNOM蛋白(Solanumlycopersicum, XP_010320912;Nicotianaattenuata, XP_019234045;Brassicanapus, XP_013641356)，以及1个单子叶植物(水稻)的预测GNOM蛋白(Oryzasative, XP_015630801)构建了系统发育树(图4).结果表明，HbGNOM与拟南芥的AtGNOM归为一类，其与同为大戟科的木薯、麻风树、蓖麻的GNOM亲缘关系最近，与单子叶植物(水稻)的亲缘关系最远.

2.2 HbGNOM基因对橡胶树白粉病菌和炭疽病菌侵染的应答在内参基因HbActin表达水平一致的情况下，对照组橡胶树叶片HbGNOM基因的表达水平无明显变化，而接种白粉病菌3天时检测出HbGNOM基因的表达量明显上调(图5).但是，接种炭疽病菌后，HbGNOM基因在不同时间点的表达量也无明显变化，与对照(未接种)中的表达水平相似.这些结果说明：HbGNOM参与了橡胶树对白粉病菌侵染的应答，但不应答炭疽病菌的侵染.

图5 白粉病菌(Odium heveae Steinm)和炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)接种橡胶树叶片对HbGNOM 基因表达的影响

2.3不同抗病信号分子处理对橡胶树叶片中HbGNOM基因表达的影响在内参基因HbActin表达量相同的情况下，与对照处理相比，ET处理橡胶树叶片12 h后HbGNOM基因的表达明显加强，72 h之后逐渐恢复正常表达水平，而SA和JA处理后对HbGNOM的表达没有影响(图6).这些结果说明：HbGNOM基因与ET介导的抗病信号途径有关，而与SA、JA介导的信号途径关系不明显.

图6 不同激素处理橡胶树叶片对bGNOM 基因表达的影响

3 讨 论

ARF 的鸟核苷酸交换因子(ARF-GEFs)能够将非活化状态的ARF-GDP 转换成活化态的 ARF-GTP，从而发挥其生物学功能[17].ARF-GEFs均含有Sec7保守结构域，该结构域能够促进ARF和GEF的结合并催化GDP/GTP的交换[18].模式植物拟南芥中已经发现8个ARF-GEF家族成员：AtGNOM(NP_172851)、AtGNL1(NP_198766)、AtGNL2(NP_1974621)、BIG1(NP_195533)、BIG2(NP_191645)、BIG3(NP_171698)、BIG4(NP_195264)和BIG5(NP_001327198)，均含有Sec7保守结构域[1].GNL1是与GNOM最近的同源蛋白，它在内体和高尔基体的运输中起着重要作用[6].拟南芥的8个ARF-GEF家族成员在细胞内的定位各不相同，其中GNOM蛋白定位于细胞的内体，参与蛋白的分拣[1]，GNL1主要位于高尔基体，为蛋白的内质网-高尔基运输所必需的成员[19]，其他成员的定位和功能还不清楚.本研究克隆和鉴定了橡胶树中GNOM的同源基因HbGNOM，从序列比对和系统发育分析的结果来看，该基因编码的蛋白与其他植物来源的GNOM具有高度同源性，且含有保守的Sec7保守结构域.根据这些结构特征推断，HbGNOM是橡胶树ARF-GEF基因家族的成员，是拟南芥AtGNOM的同源蛋白.

目前关于GNOM的研究主要集中在拟南芥，认为其是通过参与植物的囊泡运输来影响植物的生长发育的，例如参与生长素运输的调控、影响植物根部的生长、调解植物根部的向水性和向地性等[6,11-12].此外，植物在受到生物胁迫时，GNOM可以通过调控植物囊泡运输来参与蛋白的运输，从而影响植物的抗病防卫反应[20].拟南芥的GNOM蛋白可以通过介导乳突合成关键元件PEN1的运输以及增加胼胝质的累积来提高植物抵抗白粉病菌入侵的能力，从而提高植物对白粉病的抗性，该过程需要SA、JA和ET等信号传导途径的参与[14,21].目前，还没有关于HbGNOM基因参与植物对其他病害抗性的报道.本研究发现，外源ET能够诱导HbGNOM基因的表达，但SA、JA等信号分子对HbGNOM基因的表达影响不明显，白粉病菌侵染橡胶树叶片也能够引起HbGNOM基因的上调表达，暗示HbGNOM 基因参与了橡胶树对白粉病菌的抗病反应，且该过程与ET信号传导途径有关.这说明橡胶树HbGNOM与拟南芥AtGNOM在抗白粉病方面可能具有相似的生物学功能，但其中涉及到的信号传导途径存在差异.此外，在对白粉病的抗性方面，HbGNOM是否也是通过橡胶树PEN1同源蛋白来发挥其作用等，对于此类问题还需要做进一步的研究和探讨.

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Abstract：The ARF guanine nucleotide exchange factors (ARF-GEF), together with small G protein, plays roles in vacuolar sorting and protein targeting. In the study，based on the transcriptome data ofHeveabrasiliensis, an ARF-GEF was amplified by RT-PCR and named as HbGNOM. The ORF of HbGNOM was 4 410bp, encoding 1 470 amino acids. Bioinformatics analysis results showed that compared with that of GNOM fromJatrophacurcas,Manihotesculenta,RicinuscommunisandArabidopsisthaliana, the homogenicity of amino acid sequence of HbGNOM is 97%, 96%, 95% and 84%，respectively. Semi-quantitative RT-PCR analysis results indicated that the expression of HbGNOM in rubber tree leaves was significantly induced by ethylene (ET), while there are no obvious responses to salicylic acid (SA) and jasmonic acid (JA). The expression of HbGNOM was significantly induced in rubber tree leaves inoculated withOdiumheveaeSteinm, but there is no responses observed when the rubber leaves were infected withColletotrichumgloeosporoiodes. These findings suggested that HbGNOM might involve in the ET-mediated signaling pathway and the rubber tree resistance to powdery mildew.

Keywords：Heveabrasiliensis; HbGNOM; expression analysis

CloningandExpressionAnalysisofanARFGuanineNucleotideExchangeFactorsNamedasHbGNOMinHeveabrasiliensis

Zheng Xingyu, Wang Qingnan, Luo Hongli

(Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource, Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou 570228, China)

Q 3

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2017.0039

2017-04-12

国家自然科学基金项目(31160151，31360424)；海南省自然科学基金项目(314047)

郑昕宇(1992-)，男，吉林舒兰人，海南大学热带农林学院2014级硕士研究生

罗红丽(1973-)，女，河南邓县人，研究员，硕士研究生导师，研究方向：植物与病原微生物的相互作用，E-mail：hlluo@hainu.edu.cn

1004-1729(2017)03-0246-07