利咽颗粒提取工艺研究

林辉，周玉君，徐涛

利咽颗粒提取工艺研究

林辉1，周玉君1，徐涛2

目的：优化利咽颗粒提取工艺条件。方法：通过正交试验分别考察水提工艺中加水量、提取时间、提取次数对黄芩苷转移率、干膏得率的影响，以及醇沉工艺中乙醇浓度、水提浓缩液的相对密度、醇沉时间对黄芩苷转移率的影响。结果：最佳水提工艺为10倍量水，提取3次，每次1 h；最佳醇沉工艺为：滤过后的水提取液浓缩至相对密度为1.13～1.15（80 ℃），加乙醇使含醇量达70%，静置12 h。结论：优选出的最佳提取工艺稳定可行，为利咽颗粒的生产提供相关依据及参考。

利咽颗粒；黄芩苷；正交试验；工艺研究

利咽颗粒由黄芩、板蓝根、山豆根、地黄、玄参等中药组成, 具有清热养阴、化痰利咽的功效[1]。用于咽部红肿，疼痛，灼热干燥，异物感，干咳诸症的改善。笔者参考有关文献[2]，对利咽颗粒制备工艺进行了认真分析，通过正交试验方法优选出利咽颗粒的最佳提取工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2010CHT液相色谱系统（四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、LCsolution色谱工作站，日本岛津公司），CP225D型十万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司），DJ-50001型电子天平（福州华志科学仪器有限公司），DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（巩义市予华仪器有限责任公司），Mill-QⅡ型超纯水制造机（Millipore公司），低温高速离心机（德国 Sigma公司）。

1.2 试药

甲醇（色谱纯，天津赛孚世纪科技发展有限公司），超纯水（Milipore 制备），黄芩苷对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号110721-201316），磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司），药材黄芩、板蓝根、山豆根、地黄、玄参、麦冬、白芍、浙贝母、牡丹皮、桔梗、薄荷、蝉蜕、甘草、肉桂（均购自四川新荷花中药饮片股份有限公司，内含厂家检验报告）。

2 方法与结果

2.1 提取液制备

取处方量十一味与提取挥发油后的药渣合并，加入一定量的水煎煮提取一定时间，过滤、得煎液，合并提取挥发油后的药液，滤过，计量，备用。

2.2 干膏得率测定[3]

精密称取浓缩药液5.0 g，分别置于已干燥至恒重的蒸发皿（设质量为m1）中，水浴挥干，残渣于105 ℃ 干燥3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定总质量（m2），通过公式如下计算其干膏得率：

2.3 黄芩苷含量测定

2.3.1 色谱条件[4]色谱柱：Kromasil C18（250 mm×46 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-磷酸（47:53:0.2）；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2000，柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含120.9168 μg 的溶液，再精密吸取一定量加甲醇稀释成每1 mL含60.4584 μg 的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 取“2.1”项下的提取液适量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 阴性样品溶液的制备 按照利咽颗粒水提处方的提取制备工艺制得缺黄芩的阴性样品，取阴性样品适量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3.5 标准曲线制备 精密吸取“2.3.2”制备的黄芩苷对照品适量，以甲醇溶解并分别稀释为22.6719 μg/mL、30.2292 μg/mL、60.4584 μg/mL、90.6876 μg/mL、120.9168 μg/mL的对照品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条件进样测定，以进样浓度（μg/mL）为横坐标X，峰面积为纵坐标Y进行线性回归处理，回归方程为Y=39045X-28255，r=0.9999（n=5），线性范围为22.6719 μg/mL～120.9168 μg/mL。结果表明黄芩苷在线性范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.3.6 专属性实验 取上述浓度为60.4584 μg/mL的黄芩苷对照品溶液，供试品溶液，阴性样品溶液按上述色谱条件进样测定，结果显示供试品和对照品在相同保留时间处有相同色谱峰，而阴性样品未见相应色谱峰，表明杂质等对主成分的分析无干扰，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.3.7 方法学考察 依照方法学考察要求，分别进行精密度、稳定性、重复性及加样回收率考察。精密度试验以黄芩苷峰面积RSD为0.64%，表明仪器设备的精密度良好；稳定性试验以0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h内黄芩苷峰面积RSD为1.02%，表明供试品溶液在24小时内稳定；重复性试验测得黄芩苷含量的RSD为0.78%，表明测定方法的重复性良好；加样回收率试验测得黄芩苷回收率在98.59～100.20%之间，平均回收率为99.48%，回收率RSD为0.55%，回收率良好。

2.3.8 黄芩苷转移率的计算 根据含量测定结果计算黄芩苷的转移率，计算公式为：黄芩苷转移率=nC1V/MC2×100% 。其中：n为提取液稀释倍数；C1为提取液中有效成分浓度（mg．mL-1）；V为提取液体积（mL）；M药材的重量（g）；C2为药材含量（mg/g）。

2.4 水提工艺研究

2.4.1 正交试验设计 为考察水提工艺条件对提取效率的影响，采用L9(34）正交试验表进行设计，对加水量/倍（A）、提取时间/h（B）、提取次数/次（C）、进行工艺研究，以黄芩苷转移率、干膏得率分数进行综合加权评分，权重系数分别为0.8和0.2，因素水平见表1。

表1 水提正交试验因素水平表

2.4.2 正交试验工艺 取处方量十一味与提取挥发油后的药渣合并，按照正交试验表进行操作，合并煎液及提取挥发油后的药液，滤过计量体积，备用。分别测定黄芩苷转移率和干膏得率。

2.4.3 正交试验结果 按照因素水平进行操作，测定计算各正交样品的黄芩苷转移率和干膏得率，并计算综合评分（综合评分＝干膏得率/干膏得率最大值×20%＋黄芩苷转移率/黄芩苷转移率最大值×80%），极差及方差分析结果分别见表2、表3。极差分析结果表明，影响水提效率的因素依次为C＞A＞B，直观分析最佳组合为 A3B1C3。 方差分析结果表明，加水量、提取时间对提取效率的影响无统计学意义，提取次数对提取效率的影响有统计学意义（P＜0.05），确定最终工艺为A3B1C3，即加10倍量水，提取3次，每次提取1 h。

表2 水提正交试验极差分析表

表3 水提正交试验方差分析表

2.4.4 最佳水提工艺验证 按照“2.4.3”项下最佳水提工艺制备3批样品，测定样品中黄芩苷转移率及干膏得率，结果3批样品中黄芩苷转移率均值为72.8%，干膏得率均值为26.1%，表明该工艺稳定可行。

2.5 醇沉工艺研究

2.5.1 正交试验设计 水提醇沉法是中药口服固体制剂精制最常用的方法，主要是除去蛋白质、多糖等高分子成分，以能获得较少的服用剂量[5]。采用L9(34）正交试验表进行设计，对乙醇浓度/%（A）、水提浓缩液的相对密度/d（B）、醇沉时间/h（C）、进行工艺研究，以黄芩苷转移率为指标，因素水平见表4。

表4 水提正交试验因素水平表

2.5.2 正交试验工艺 取处方量十一味与提取挥发油后的药渣合并，按照最优水提工艺，加入10倍量水，提取3次，每次1 h，合并煎液及提取挥发油后的药液，滤过，将提取液浓缩成不同相对密度的浓缩液，按正交试验条件进行醇沉、过滤。测定黄芩苷转移率。

2.5.3 正交试验结果 按照因素水平进行操作，测定计算各正交样品的黄芩苷转移率，极差及方差分析结果分别见表5、表6。 极差分析结果表明，影响醇沉效率的因素依次为A＞C＞B，直观分析最佳组合为A3B3C2。方差分析结果表明，水提浓缩液的相对密度、醇沉时间对提取效率的影响无统计学意义，乙醇浓度对提取效率的影响有统计学意义（P＜0.05）。考虑生产周期及成本因素，将最终工艺确定为A3B2C1，即滤液浓缩至相对密度为1.13～1.15（80℃），加乙醇使含醇量达70%，静置12 h。

表5 醇沉正交试验极差分析表

表6 醇沉正交试验方差分析表

3 验证试验结果

为进一步验证正交试验结果的准确性，以确保提取工艺合理可行，按上述优选水提及醇沉工艺[6]，重复试验3次。取处方量十一味与提取挥发油后的药渣合并，按照最优水提工艺，加入10倍量水，提取3次，每次1小时，合并煎液及提取挥发油后的药液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.13～1.15（80 ℃），加乙醇使含醇量达70%，静置24小时。按上述干膏得率测定方法和黄芩苷转移率测定方法测定。结果3批样品中干膏得率均值为20.1%，黄芩苷转移率均值为62.2%，说明该水提醇沉工艺条件基本稳定，具有可重现性。

4 讨论

中药颗粒剂是在汤剂基础上发展起来的剂型，开始出现于70年代，辅料多以蔗糖和糊精为主；颗粒剂继承了传统中药水煎服用的特点，既有汤剂的综合疗效好、易吸收、显效快的优势，同时还克服了传统方剂服用量大以及因工艺设计的合理性而造成的有效成分被破坏的问题[7]。五十年代后期，中药的提取工艺就有水提醇沉法的记载[8]，水提醇沉法是目前应用较广泛的精制方法，《中国药典》现行版所载玉屏风口服液、抗感颗粒都用本法进行精制;医院制剂以及营养保健口服液中很大一部分都应用了水提醇沉法[9]。通过醇沉，能除去绝大部分水煎液中的无机成分、淀粉、鞣质、色素、蛋白质、粘液质、树胶和果胶等水溶性成份。

黄芩为利咽颗粒的主要成分，具有清热燥湿、泻火解毒的功效。近年来通过对黄芩活性成分的研究，发现黄芩有抗炎、抗菌的药理作用[10-11]。黄芩中主要化学成分为黄酮及其苷类、萜类化合物及挥发油[12]，其中最主要的黄酮类化合物为黄芩苷，所以本试验采用正交设计法进行优化，选择黄芩苷转移率[13]和干膏得率进行综合评价[14]，依据各工艺参数对制剂提取结果的影响，优选出的最佳参数，保证工艺稳定可行，为利咽颗粒的生产提供相关依据及参考。

[1] 利咽颗粒的薄层色谱鉴别 齐鲁药事,2005,2(24)

[2] 清热解毒口服液生产工艺及质量稳定性的研究[J].中式药,1997,19(5)

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2015年版四部[M].北京:中国医药科技出版社2015:202

[4] HPLC法测定喘嗽宁片中黄芩的含量 内蒙古中医药 2010,21(124)

[5] 正交试验法优选清瘟解毒分散片提取工艺 中国社区医师.医学专业 2011,31

[6] 柴苓护肝颗粒的优化工艺 环球中医药 2015,12(8)

[7] 浅述日本汉方药颗粒剂的研制与发展 中国药业 2000,9(7)

[8] 对水提醇沉工艺的一点浅见 中成药研究 1986,5

[9] 中药制剂发展的回顾 中成药 2000,1(1)

[10] 中药黄芩的药理和应用[J] 中医临床研究,2014,6(3): 133-134.

[11] 中药黄芩的化学成分及药理研究进展[J] 中华中医药学刊,2015,33(1): 206-211.

[12] 黄酮的化学成分与药理作用研究进展[J]中成药,2016,38(1):141-147.

[13] 清喉利咽含片提取工艺的研究 中药临床研究,2012,4(8)

[14] 正交试验法优选清肺健中颗粒的提取工艺 陕西中医2016,11(37)

(责任编辑：傅舒)

Study on the extraction technology of Liyan granules/

LIN Hui1, ZHOU Yu-jun1, XU Tao2//( 1. Chengdu Yilukang Medical Technology Service Limited Company, Chengdu 610023, Sichuan; 2. Sichuan Nursing Vocational College, Chengdu 610100,Sichuan)

Objective:The study aimed to optimize the extraction technology of Liyan granules.Method:The orthogonal experiments were carried out to study the water extraction and alcohol precipitation process of Liyan granules. In the water extraction technology, the in fl uence of the amount of water, extraction time and extraction times on baicalin transfer rate and dry paste yield was investigated. In alcohol precipitation technology, the in fl uence of alcohol concentration, the relative density of water extraction concentrated solution and the time of alcohol precipitation on baicalin transfer rate was investigated.Result:The optimum condition of water extraction technology of Liyan granule was as follows: adding 10 times of water, extracting three times for one hour each time. The optimum condition of alcohol precipitation technology was as follows: combining the fi ltrated water extraction solution, concentrating to a relative density of 1.13 ～ 1.15 (80℃), add ethanol to make alcohol content of 70%,standing for 12 hours.Conclusion:The optimum extraction process is stable and feasible, which provides the basis and reference for the production of Liyan granules.

Liyan granule; baicalin; orthogonal test; technological research

R 285.5

A

1674-926X(2017)03-010-03

1.成都医路康医学技术服务有限公司 成都 610000

2. 四川护理职业学院 成都 610000

林辉 (1980-)，男，硕士研究生，制药工程师，研究方向:中药新药的研究与开发。

Tel:(028)85588854 Email:linhui0708@163. com

2016-06-12