中药防治耐药菌感染创新药物发现模式：“方-病证-菌、药-病证-菌、部位-病证-菌、成分-病证-菌、物质结构-网络关系-作用靶标”

彭 成

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中药防治耐药菌感染创新药物发现模式：“方-病证-菌、药-病证-菌、部位-病证-菌、成分-病证-菌、物质结构-网络关系-作用靶标”

彭 成

【专家介绍】彭成，中药专业博士、二级教授，出生中医世家。现为成都中医药大学副校长、中华人民共和国《药典》委员会委员、国务院学位委员会中药学科评议组成员、全国高等中医药院校药学类规划教材编委会主任委员、国务院政府津贴获得者、新世纪百千万人才工程国家级人选、世界中医药联合会道地药材多维评价专委会理事长、中国中药协会中药材检测与认证专委会主任委员。先后负责国家自然科学基金重点项目、国家科技支撑计划重点项目、国家973计划课题、国际合作项目等30多项；发表论文360多篇、SCI论文130篇，主编学术著作20多部；获授权专利37项；先后培养博士后16人、博士研究生53人。提出有毒中药“毒性物质基础—毒作用机制—控毒方法体系”的安全性评价模式，研究有毒中药，主编创新教材《中药毒理学》，组建国家中医药管理局重点培育学科“中药毒理学”；以道地药材为研究对象，提出中药“品质制性效用”多维评价方法，组建“西南道地药材协同创新中心”，系统研究和开发道地药材，主编国家“十二五”重点图书《中华道地药材》；提出中医药动物实验的技术，创制病证模型，建立《中医药动物实验方法学》；提出“方病证、药病证、有效部位与病证、有效成分与病证”的中药创新药物发现模式，筛选创新中药，获国家发明专利37项。本文拟在中药创新药物发现模式提出的基础上，针对目前全球抗生素耐药日益严峻、抗耐药菌药物紧缺的现状，首次提出“方—病证—菌”、“药—病证—菌”、“有效部位—病证—菌”、“有效成分—病证—菌”、“物质结构—网络关系—作用靶标”的中药防治耐药菌创新药物发现模式，建立抗耐药菌发现与评价的技术体系，为解决日益严重的细菌耐药性问题提供新思路、建立新体系、开发新药物。

1 中药防治耐药菌感染创新药物发现模式的提出缘由

1.1 耐药菌感染已经成为危害公共安全和人类健康的重大疾病

近年来，随着抗菌药物的增加和广泛应用，细菌耐药性问题日益突出，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素肺炎链球菌 (PRSP)、耐万古霉素肠球菌 (VRE)、产超广谱β-内酰胺酶 (ESBL)肠杆菌、多种耐药性结核杆菌 (MDRMT) 等超级耐药致病菌相继产生和扩散，严重危害公共安全和威胁人类健康，减少耐药菌株的生成和研制新的抗菌药物不仅成为医药界必须解决的重大问题，而且引起了国际社会和各国政府的高度关注。2014年，WHO首次发布了全球抗生素耐药报告；2016年，联合国在纽约联合国总部召开“抗生素耐药性问题高级别会议”，WHO再次发布报告，全面审视了全球的耐药菌情况。2016年在杭州举行的二十国集团（G20）领导人峰会，专门提出要推动全球应对抗生素耐药性问题。美国、中国等国家高度重视耐药菌的危害和防控，美国政府2015年制定了为期5年的抗击耐药细菌国家行动计划；中国政府制定了《遏制细菌耐药国家行动计划（2016—2020 年）》。耐药菌感染，已经成为危害世界公共安全和人类健康的重大疾病。

1.2 中医药防治感染性疾病具有确切的疗效和明显的优势

感染性疾病在中医典籍中常被称为外感疾病，有外感热病、伤寒、温病、温疫等称谓。汉代张仲景《伤寒论》，是第一部系统论述外感病的专著，创立六经辩证；隋代《诸病源候论》，将伤寒病、时气病、热病、温病，列为外感热病常见的四大病证；明代吴又可《温疫论》，是中医第一部防治感染性疾病的专著；清代叶天士创立卫气营血辨证、吴鞠通创立三焦辨证。至此，外感热病辨证论治体系趋于完整。几千年来，中医药为中国人民的健康，尤其是在预防和控制感染疾病方面做出了重大贡献。

外感热病的防治，在《素问•热论》中就有：“三阳经络皆受其病，而未入于脏者，故可汗而已。……其未满三日者，可汗而己；其满三日者，可泄而已。”张仲景《伤寒论》则根据主要病机，采取不同的治法，邪在三阳，用汗法、清法、下法、和法等，邪在三阴，也可用汗法、温法、补法、清下法等。晋代葛洪《肘后方》不仅描述了天花等传染病，而且记载了青蒿、葱豉汤、葛根解肌汤等许多治疗外感病卓有成效的方药。金元时期，刘完素为外感热病的辨证选药开拓新意，认为六气皆从火化，热病只能从热治，倡导重用寒凉，解表药与寒凉药并用，并提出了双解散、天水散、防风通圣散、凉膈散等新方；而张从正强调三因制宜，重视祛邪，为辛凉解表法的发展奠定基础；李东垣则创建了清暑益气汤、普济消毒饮等疗效较好的防治外感病方刻。明代全国瘟疫横行之际，吴又可撰写《温疫论》，开创我国传染病学研究之先河，大胆提出“疠气”致病之学说，在世界传染病学史上是一个伟大的创举。清代，叶天士提出“在卫汗之可也，到气方可清气，入营犹可透热转气，入血则恐耗血动血，直须凉血散血”作为温热病的治疗原则；而吴鞠通根据温病过程中上、中、下三焦所引起的病理变化，提出“治上食如羽，非轻不举；治中焦如衡，非平不安；治下焦如权，非重不沉”。

概言之，中医学认为，感染性疾病属于中医外感疾病范畴，其中“疫疠”是一类危害极大、难以控制的疾病。“祛邪”、“扶正”、“调节”是中医药治疗细菌感染疾病的重要指导原则，也是在防治耐药菌感染方面，中医药区别于西医药的关键特征。

因此，面对全球愈演愈烈的细菌耐药性难题和人类面临“超级细菌感染”带来的“后抗生素时代”的严峻现实，研发创新型抗耐药菌感染新药成为当前医药界的头等大事，而基于中医药系统、整体、辨证的医疗实践和现代创新药物研发技术，提出并构建中药防治耐药菌感染创新药物发现模式，具有重要意义。

2 中药防治耐药菌感染创新药物发现模式的主要内容

笔者基于“中药—机体—耐药菌”三大系统的多维关系和“中药复方-单味药物-有效部位-有效成分”的系统思考，在10多年抗耐药菌研究的实践基础上，提出 “方-病证-菌”、“药-病证-菌”、“有效部位-病证-菌”、“有效成分-病证-菌”和“物质结构-关系网络-作用靶标”的中药防治耐药菌感染创新药物发现模式，并成功建立了抗MRSA、MRCNS、VRE、ESBLs、CRE、CR-AB、MDR/PDR-PA等多重耐药菌感染性疾病筛选模型，对10余种中药复方、100余味单味中药和有效部位、有效成分的抗耐药菌活性进行了筛选，发现体内外具有确切抗耐药菌感染疗效的创新中药。现结合我们团队的研究成果，阐述中药防治耐药菌感染创新药物发现模式的内涵。

2.1 方-病证-菌

“方”即中药复方，“病”为现代医学的疾病，这里指感染性疾病，“证”为中医证侯，这里指外感疾病的证候，“菌”指细菌，这里主要是耐药菌。

中药复方是指在中医药理论指导下，在中药品质性效用的基础上，针对中医病证的病因病机，应用“君臣佐使”、“七情合和”等组方原理，将两味或两味以上的中药配伍组合使用的形式。中药复方具有整体性、有序性、恒定性、可变性、可控性的特点。中药复方是一个整体，它是针对疾病主治病证的病因病机，立法处方、随证用药；概言之，就是针对病机，方证对应、方证一体。中药复方的组成是有序的，它是按照“君臣佐使”的结构进行组方，按照“七情合和”的原则进行配伍。中药复方的组方是恒定性，尤其是基础方、代表方，药物的组成是恒定的、有效的。中药复方是可以随证进行药味的加减，进行药物剂量的调整，这就是中药复方的可变性。中药复方最大的特点，就是可以根据疾病的状况和疾病发展的趋势，调控药物发挥作用的方向；调控药物治疗的范围，达到治病救人的目的。从《黄帝内经》提出了组方的理论和基本结构，载方13首、剂型6种以来，中药复方的发展经历了2000多年的历史，现存方书达2000余种，载方约10万之众。仅具有抗菌作用的中药成药制剂就有数十种，其中穿心莲内酯、清开灵注射液、双黄莲注射液、藿香正气口服液、抗病毒口服液、一清胶囊、莲花清瘟胶囊、正柴胡饮颗粒、金莲清热颗粒、板蓝根颗粒、感冒清等抗菌效果较好。

感染性疾病是指病原体感染人体后引起的疾病，病原体包括病毒、衣原体、支原体、立克次体、细菌、真菌、螺旋体、原虫、蠕虫等微生物。感染性疾病中具传染性，并可导致不同程度流行的疾病，又名传染病。感染性疾病的临床表现，取决于微生物、宿主和环境之间相互作用的结果，病程一般分为潜伏期、前驱期、症状明显期、恢复期，其中，发热是感染性疾病的突出症状和共同表现。感染性疾病的治疗，包括特异性病原治疗和一般对症治疗。中医将感染性疾病归为外感热病，包括伤寒、温病、温疫三大类疾病，用方包括银翘散类、白虎汤类、承气汤类、清营汤类、至宝丹类等不同。

耐药菌是指在长期的抗生素选择之后出现的对相应抗生素产生耐受能力的微生物，统称耐药菌。多重耐药菌，是指有多重耐药性的病原菌。细菌的耐药性，是指细菌多次与药物接触后，对药物的敏感性减小甚至消失，致使药物对耐药菌的疗效降低甚至无效。目前，常见的耐药菌有MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）、ESBLs（超广谱β-内酰胺酶）、VRE（耐万古霉素的肠球菌）、MDRAB（多重耐药鲍曼不动杆菌）、MDRPA（多重耐药铜绿假单胞菌）、多种耐药性结核杆菌 (MDRMT) 等超级耐药致病菌。

中药复方治疗耐药菌感染，确有疗效。如，于国东等研究白虎加人参汤治疗下呼吸道多重耐药菌感染，临床观察发现，白虎加人参汤加味治疗下呼吸道多重耐药菌感染患者能有效控制发热症状，能减轻感染引起的炎症反应[1]。我们团队研究了《百一选方》回生散对MRSA的影响，发现，广藿香、尤其广藿香挥发油对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）较好的抑菌作用，虽然陈皮、陈皮挥发油未表现出明显活性，但广藿香与陈皮按古方比例配伍（1:1）后，不仅减少了广藿香油的用量，而且表现出良好的抗菌活性，具有协同增效作用。为了体现病证结合，我们团队建立了热毒血瘀耐药菌感染病证模型，研究发现，黄连解毒汤总生物碱抑菌活性最强，其次为水提物组、总黄酮组，总生物碱抑制革兰阳性菌的MIC为8.37 ± 5.05 mg．mL-1；总生物碱和总环烯醚萜能调节败血症大鼠血流变异常、降低血液粘度，水提物能降低模型大鼠的白细胞和血小板升高；总黄酮组能明显降低热毒血瘀证模型动物肛温，各组分群使热毒血瘀证模型大鼠的血液全血粘度或压积明显降低，总生物碱还能明显降低全血高切还原粘度，各提取物均明显降低热毒血瘀证大鼠血浆内皮素-1的含量，水提物和总生物碱明显降低热毒血瘀证大鼠血浆肿瘤坏死因子-α含量[2～3]。

2.2 药-病证-菌

药即单味中药。中药具有“毒性小、安全范围大、作用靶点多、广谱性强”等特点，不仅有广谱抗菌活性，还具消除耐药质粒、抑制多重耐药菌外排泵、抑制β-内酰胺酶、抑制耐药基因表达等逆转细菌多重耐药性的作用。如，梁勤等研究甘肃道地中药大黄、黄芩对多重耐药菌的抑菌活性，结果：大黄对产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的最小抑菌浓度分别为 250 mg．mL-1和 125 mg．mL-1，黄芩对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的最小抑菌浓度为 250 mg．mL-1；对产超广谱 β- 内酰胺酶(ESBLs)大肠杆菌未见明显抑菌作用[4]。再如，吴贤丽等，研究6种中药对60株泛耐药鲍曼不动杆菌的抑菌作用，结果，黄芩、连翘、黄连、金银花、五味子、乌梅对60株泛耐药鲍曼不动杆菌有不同程度的体外抑菌作用[5]。我们研究团队，对解表类、泻下药、清热类、化湿类、收涩类等100多味中药取物进行了MRSA细菌120多株（含2株MRSA标准株ATCC43300、ATCC33591，120株分离于人和动物临床的分离株）体外抑菌试验，发现，大多数中药提取物具有不同程度的体外广谱抗菌活性，对革兰阳性菌的活性较优，其中对MRSA和MSSA两者的活性差异不明显。解表药香薷、柴胡，清热药黄连，芳香化湿药广藿香、厚朴，收涩药诃子，止血药地榆等有较强的抗菌活性；有5味中药具有明显体内抗MRSA感染疗效；奶牛临床疗效试验研究表明，有3味中药具有治疗奶牛临床型乳腺炎的明显疗效。

2.3 有效部位-病证-菌

有效部位包括溶剂有效部位和药物有效部位，溶剂有效部位有石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇等提取部位，药物有效部位包括生物碱、黄酮、皂苷、蒽醌、萜类、挥发油、多糖、多酚、鞣质以及有机酸等。如，张民在细菌耐药背景下的中药抗菌作用探析一文中总结，黄连中的小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱等对多种 G + 和G -菌均有抑制作用；白花蛇舌草所含总黄酮对球菌和杆菌均具有不同程度的抑制和杀灭作用；连翘、金钱草、金银花的抗菌有效成分以绿原酸、异绿原酸和黄酮类化合物为主；黄芩的主要抑菌成分黄芩苷和黄芩素具有广谱抗菌作用，其中黄芩苷可抑制和破坏细菌生物被膜，并可增强头孢他啶对生物膜内铜绿假单胞菌的抗菌活性，这也为耐药菌的治疗提供了一种新思路；苍术挥发油对金葡菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、青霉、黑曲霉、黄曲霉等具有相当强的抑菌活性；临床常用的泻下清热解毒药大黄，其抗菌的主要有效成分大黄酸、大黄素和芦荟大黄素均是蒽醌类化合物，对葡萄球菌、链球菌等 G + 菌和痢疾杆菌、大肠埃希菌等 G - 菌均具抗菌活性，而芦荟大黄素对幽门螺杆菌亦有一定的抑制作用；鞣质在中草药中广泛存在，因能凝固微生物体内的原生质以及对多种酶的作用，常呈现广谱抗菌特性，对多种细菌、真菌都有明显的抑制能力，并具有一定抗耐药菌作用[6]。我们研究团队对中药有效部位研究的结果发现，广藿香油对15个种属的117株耐药菌和敏感菌均有较强的体外抑菌活性，MIC为0.26～8.17 mg．mL-1，0.49 g．kg-1肌肉注射对金黄色葡萄球菌耐药菌和大肠埃希菌耐药菌感染小鼠有100%的保护力，并呈量效关系。

2.4 有效成分-病证-菌

有效成分是指中药中具有生物活性，能代表其功效的化学成分。如，板蓝根、穿心莲、黄柏和鱼腥草等的单体成分小檗碱、大黄素、穿心莲内酯和去氢贝母碱是其抗菌活性成分，花旗松素、黄芩素、二氢杨梅素、原花青素、没食子酸、姜黄素、熊果酸、白秋李醇、水飞蓟宾、芦竹碱、杨梅苷中药单体对MRSA具有抑制活性[7]。我们研究团队广藿香油抗MRSA疗效的基础上，对广藿香药材的产地、药材生长周期、采收时间、挥发油工业化提取方法、质量标准进行了研究。发现，（1）广藿香中百秋李醇抗G+、广藿香酮抗G-效果较好，而《药典》中仅将百秋李醇作为含量测定的标准欠妥，建议将百秋李醇、广藿香酮均作为广藿香含量测定指标。（2）道地产区阳春所产广藿香的质量较好，百秋李醇、广藿香酮含量较高。（3）广藿香油中抗革兰氏阳性菌的主要药效成分百秋李醇在轻油部分，抗革兰氏阴性菌的主要药效成分广藿香酮在重油部分，广藿香油的提取应该包括重油和轻油。并应用高通量测序技术对广藿香有效成分生物合成代谢途径的分子机制进行了研究。通过广藿香全基因组测序分析，为广藿香的基因组学研究提供了大量基因组序列和结构信息，为了解广藿香的进化历史、次生代谢产物生物合成的分子机制以及生长、发育、繁殖等生物学基本过程提供了重要的资料；通过转录组测序分析，经寻找有明显差异的广藿香样品间的差异基因，分析广藿香醇和广藿香酮的代谢通路，最终为进一步探讨这两种广藿香主要的次生代谢产物的代谢调控机制和为广藿香进行药用有效成分改良和优良品种选育奠定基础。

2.5 物质结构-关系网络-作用靶标

中药的活性物质具有多样性，中药活性物质的空间结构具有复杂性。不同活性成分、不同母体结构，药效作用或药效作用的强弱不同；相同的骨架、不同的衍生物、不同的手性，药效作用及作用的强弱不同。药物研发方面，基于药物结构设计的计算机辅助设计、分子标靶、反向分子对接、药效团筛选、片断药物发现、 3D技术应用等新技术、新方法层出不穷。

由于烈性传染病、慢性病、复杂疾病的挑战 ，原来“一个药物，一个靶标，一种疾病”为主导的传统新药研发模式已经结束，基于系统生物学、组学、网络药理学、计算毒理学为基础，结构生物信息学为主导的多层次、多靶点、复杂网络多重药理学模式势在必行。

我们团队，在ADME/T和构效关系指导下，通过反向找靶，进行了有目的性和针对性的结构优化，构建了新的广藿香酮衍生物库；根据高成药性结构优化和传统的药物化学设计原则，设计合成了两大类藿香酮衍生物：①13个全新的直链大共轭衍生物，所有化合物经1H NMR、13C NMR、HRMS和单晶衍生确证了结构，该系列衍生物具有取代基位置、类型的多样性，且能实现克级规模的实验室制备规模。②已合成并鉴定了20余个侧链为环状，且具有多手性中心和氢键受体的藿香酮衍生物。经体外抗菌活性和初步的抗菌机制研究，以及广藿香醇和广藿香酮药代动力学。结果显示：①广藿香酮衍生物PPCl对金黄色葡萄球菌敏感，其MIC值为4 μg．mL-1，MBC值为4 μg．mL-1，约为广藿香酮的128倍，且其对临床分离耐药菌株与敏感菌株都有同等活性；化合物PPCl能延长金葡菌的生长迟缓期，抑制细菌生长繁殖，并呈浓度依赖性，32 μg．mL-1作用4 h即可杀灭83%的金葡菌，6 h全部杀灭，还能轻微破裂细菌胞膜，引起约15%的大分子物质（包括β-半乳糖苷酶）泄漏至胞外，但不能破裂脂质体膜，电镜观察显示其作用细菌后，细菌细胞呈现出严重核固缩现象，最后细菌胞内物质崩解，细菌死亡，但不引起细胞壁破裂；而16 μg．mL-1和8 μg．mL-1浓度时杀菌作用温和，作用6 h分别杀灭39%和22%的金葡菌，需作用24 h才可全部杀灭，能轻微影响脂质体膜和细菌胞膜的渗透性，几乎不引起大分子物质泄漏；化合物PPCl能阻滞细菌细胞周期于S期，阻碍细菌分裂增殖，还能使DNA凝胶电泳的条带变淡和260 nm处的吸光度值升高，作用随化合物浓度的增加而增强，均呈浓度依赖性。②化合物A18作用金黄色葡萄球菌后，能使其DNA凝胶电泳条带呈弥散状，还能显著抑制其DNA、RNA、ATP和蛋白质的生物合成，降低碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等胞内酶的活性。③化合物B13、B14对耐甲氧西林的葡萄球菌（MRSA）的效果优于化药，MIC值为3.125 μg．mL-1。④通过生物药剂学和药动学手段研究广藿香有效成分——广藿香醇和广藿香酮的体内过程、跨膜转运机制及外排转运体对其影响，为广藿香的质量评价、临床合理应用提供生物药剂学和药动学的依据。研究工作选择整体动物模型和细胞模型系统地研究了广藿香醇和广藿香酮在大鼠体内药动学过程，结合细胞模型对广藿香醇和广藿香酮的跨膜机制进行探讨，评价了三种外排转运体对其跨膜的影响[8～11]。

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（责任编辑：陈思敏）

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 610075

2017-02-01