Ras协同mTOR/SREBP1—c上调miR—182—96—183在肝癌中表达

崔海鹏 刘凯 林映雪 张乘云 赵娟

【摘要】目的：探讨Ras癌基因诱导的miR-182-96-183高表达机制。方法：采取H-ras12V转基因小鼠肝癌及癌旁组织，miRNA高通量测序检测miR-182-96-183基因表达水平。Wes ternblot检测调控miR-182-96-183表达的相关信号通路活化状态及其上游转录因子蛋白表达水平。结果：miRNA高通量测序结果表明：与PT相比，T中m1R-182-96-183mRNA表达显著升高（P<0.01）。Wes ternblot检测结果表明：与PT相比，T中ERK、mTOR活化水平显著升高，SREBP-lc蛋白水平显著升高。结论：Ras癌基因可能通过活化mTOR通路激活SREBP-1c上调miR-182-96-183的表达水平。

【关键词】肝癌；miR-182-96-183：Ras：mTOR：SREBP-1c

Ras信号通路激活在肝癌中普遍存在[1]。miRNAs可通過抑制其靶基因的翻译在癌症的发展过程中扮演重要角色[2]，同时有研究表明miR-182-96-183家族在多种原发性肿瘤中发挥关键作用[3]。我们前期进行的miRNA高通量测序发现miR-182-96-183在肝癌组织中显著表达，但其在Ras诱导的肝癌中高表达机制尚不清楚。本研究利用H-ras12V转基因肝癌小鼠模型[4]初步探讨了miR-182-96-183在肝癌中的表达调控机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

SPF级H-ras 12V转基因小鼠，雄性，9月龄，体重30～40g，大连医科大学SPF实验动物中心。生产许可证SCXK（辽）2016-0003，使用许可证SYXK（辽）2016-0006。

1.1.2试剂

抗体p-ERK、p-mTOR、SREBP-1c购自Cell Signal公司。

1.1.3仪器

BG-blotMINI垂直转印仪等。

1.2方法

1.2.1组织样本的采集

分别采取转基因小鼠肝癌和癌旁组织，迅速液氮冷冻保存。

1.2.2 miRNA高通量测序

组织样本送至晶能生物公司进行Illumina miRNA测序。具体方法参见文献。

1.2.3 Westemblot检测

45μg蛋白10%SDS-PAGE分离并转膜，封闭，一抗孵育过夜。二抗孵育1h，显影，实验重复三次。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计分析。计量资料以x土s表示，Shapiro-Wilk法检验数据符合正态分布，根据Levene方差齐性检验，两组间差异比较采用t检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.1基因芯片检测转基因小鼠肝组织miR-182-96-183表达水平

高通量miRNA表达测序分析如表1，H-ras12V转基因小鼠肝癌旁组……