ELISA试剂盒在奶牛早期妊娠检测中的应用

雷莉辉 孙 健 于凤芝 （北京农业职业学院 北京 房山 102442）

ELISA试剂盒在奶牛早期妊娠检测中的应用

雷莉辉 孙 健 于凤芝 （北京农业职业学院 北京 房山 102442）

准确、快速、操作便捷的奶牛早期妊娠诊断技术是规模化奶牛场提高繁殖效率和养殖经济效益的重要手段。本试验通过采用ELISA试剂盒(牛快速可视孕检试剂盒)，在2016年3月～2017年2月期间，对北京市房山区某规模化牛场的荷斯坦奶牛的168头份血样进行检测，并将检测结果与55～60d的直肠检查结果进行比较。结果表明，不同胎次奶牛的空怀检测准确率为97.68%～98.52%，怀孕检测准确率为98.51%～98.83%。ELISA检测作为奶牛早期妊娠诊断的措施，对规模化牛场具有重大的意义。

奶牛 早期妊娠 ELISA 牛快速可视孕检试剂盒

对奶牛在人工受精一定时间后进行精准及时的早期妊娠检测，在规模化牛场繁殖管理程序中是一项十分重要而关键的任务。采用酶联免疫测定法(ELISA)对奶牛的早期妊娠状况进行诊断，即就是通过检测从孕体、子宫、卵巢进入母体血液、尿液或乳汁的妊娠相关物质含量进行妊娠诊断。奶牛的早期妊娠诊断在奶牛生产中具有重要意义，可以尽快重配空怀奶牛并缩短产犊间隔时间，从而为奶牛场带来最高的牛奶产量和经济效益。采用酶联免疫测定法对待检牛血清的检测，操作快捷，结果准确率高，近年来在国内外针对人工授精的规模化牛场已经有广泛应用[1]。本实验通过对人工受精后的奶牛进行血清中妊娠相关糖蛋白(PAGs)的检测，结合后期对人工授精后奶牛的跟踪调查(结合55～60d的直肠检查)，通过比较得出ELISA方法的空怀检测准确率和怀孕检测准确率。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择2016年3月～2017年2月北京市房山区某规模化牛场的荷斯坦奶牛，胎次在1.76～2.92之间，平均胎次为2.53。对人工授精后25～32d的成年母牛采集尾根血液5ml，以备分离血清，共采集了待检奶牛血样168头份。

1.2 试验材料

37℃恒温箱，Eppendorf 100～1000μl、20～200μl、2～20μl微量移液器各1把，各种规格移液器配套吸头各一盒，吸水纸，牛快速可视孕检试剂盒(购自美国IDEXX公司)，去离子水。

1.3 试验步骤

1.3.1 试剂盒及样品的保存与使用 试剂盒一般应保存于4℃冷藏保存，待检血清一般应于-20℃冷冻保存。在试验开始前至少30min开始做准备，即将试剂盒中所有试剂及包被反应板取出，恢复到室温(18～26℃)，不同生产批次的试剂盒中所含检测试剂不可混用。所有试剂使用前，应轻轻涡旋、旋转使其充分混匀。待检血清可流水冲指型管或用手搓至融化，摇匀备用。

1.3.2 样品的制备 将采集的血样注入洁净试管中，静置至凝集后，待血凝块周围析出淡黄色液体时，可将试管移入冰箱4℃保存，待血清析出较多量时，吸取淡黄色液体至指型管中，即为待检血清。

1.3.3 加样 加样前先于反应板上标记好因阳性对照和所有样品的位置，根据检测需要取出所需数量的反应板条，将未使用的反应板条放入含有干燥剂的密封袋于2～8℃保存。每次加样最好按设计好的反应板布局、按统一顺序加，避免样本溅出或串孔，加样时速度要保持一致，加样后要轻弹反应板，确保每个反应孔中的液体充分混匀，同时尽量减少各样品反应时间的差异，计时要准确。

1.3.4 孵育 加样后微孔板必须用盖板将反应板盖严，进行室温孵育时，控制室温在18～26℃，避免在强光、热源附近或通风口等温度不均匀的位置进行孵育。

1.3.5 洗板 洗板时，将每个反应孔加满双蒸水或去离子水(用移液枪加液时，每孔按300μl清洗)，共洗涤3次，每次浸泡时间一般为30s。每次洗板后快速翻转反应板，弃去洗液。将反应板用力在吸水纸上拍干，确保每一个反应孔中没有残留的洗液，同时避免手指接触到孔内。

1.3.6 反应结果判读 通过对比样品和阴阳性对照呈现的颜色来判断每头动物的妊娠状况。如果样品反应空中呈现的颜色比阴性对照孔浅或相同，则判定该动物为空怀；如果样品反应孔中呈现蓝色且比阴性对照孔深，则判为PAGs存在，该动物处于妊娠期；如果样品孔颜色很难用肉眼分辨，则被认为可疑，建议重新采样复检。

2 结果

从2016年3月～2017年2月底，共计检测了168头份。以牧场55～60d的直肠检查结果为标准。人工授精后25～32d的血液检测结果准确率如附表：

附表 血液检测结果与牧场妊娠检测结果 (%)

空怀检测准确率为97.68%～98.52%，怀孕检测准确率为98.51%～98.83%。在产犊平均胎次为1.65的35份样品中，空怀检测准确率为97.68%，怀孕检测准确率为98.51%；在产犊平均胎次为2.23的65份样品中，空怀检测准确率为98.14%，怀孕检测准确率为98.72%；在产犊平均胎次为3.26的35份样品中，空怀检测准确率为98.52%，怀孕检测准确率为98.83%。

3 讨论

3.1 空怀检测准确率分析

空怀检测准确率是指人工授精后25～32d血液检测空怀和55～60d直肠检查结果空怀的比值。从附表结果看，这168份样品的空怀检测准确率最理想可达到98.52%。怀孕检测准确率是指人工授精后25～32d血液检测怀孕和55～60d直肠检查结果怀孕的比值。从表1结果可以看出，怀孕检测准确率最理想可达到99.83%。检测结果这说明总有一定比例奶牛在55～60d直肠检查为空怀，主要原因可能是胚胎30～56d容易发生早期死亡，有的能被发现，也有的不易观察到[2]。这与Piechotta M等在2010年应用IDEXX公司的奶牛PAG-ELISA妊娠检测试剂盒对人工授精后28～58d的奶牛进行检测的结果(妊娠诊断准确率能达到97.8%)基本一致[3]。

3.2 关于ELISA试剂盒

多种哺乳动物在妊娠时，胎盘的滋养层双核细胞会表达出一类蛋白物质，叫做妊娠相关糖蛋白(PAG)，从外周血液中测定这种蛋白可疑作为是否有胎儿存在的指标[4]。奶牛在妊娠后PAG浓度即开始缓慢上升，一直持续到妊娠的第22天，达到2ng/ml以上，此时，妊娠奶牛和非妊娠奶牛体内PAG浓度有了明显差别[5]。在本研究中，采用美国IDEXX公司的牛快速可视孕检试剂盒对奶牛血清样品中的PAGs进行检测就可以较精准的来判定奶牛是否怀孕。在使用试剂盒前，必须将试剂盒中所有的组分恢复到18～26℃，试剂通过旋转完全混合均匀，这样才能保证所有检测试剂的有效性与准确性。

3.3 ELISA法进行早期妊娠诊断的优势

本试验中采用的牛快速可视孕检试剂盒提供了一种可以精准检测怀孕的实验室检测方法，可以早在配种后28d就可以检测到牛是否怀孕，在奶牛生产上对提高繁殖效率具有十分重要的意义。样品可以实行批量检测，特别适合规模化牛场的兽医进行早期妊娠诊断，且空怀检测准确率为97.68%～100%，怀孕检测准确率为98.51%～98.83%，便于牛场管理者及时做出繁殖管理决策，对妊娠期的奶牛加强营养，保证分娩的顺利进行；对未妊娠的奶牛及时处理，再次诱导排卵，进行人工授精，缩短产犊间隔。

[1] Balhara K, GUPTA M, SINGH S, et al． Early pregnancy diagnosis in bovines: Current status and future directions[J]. The scientific world Journal, 2013: 1-10.

[2] 王传蓉, 刘光磊, 张春刚等. “优孕凯斯”检测技术在奶牛早期妊娠诊断中的应用[J]. 中国奶牛. 2016(03): 25-28.

[3] Piechotta M,Bollwein J,Friedrich M, et al.Comparison of commercial ELISA blood tests for early pregnancy detection in dairy cows[J]. Report Dev, 2010, 45(1): 142-146

[4] 钟旭, 薛立群, 田见晖. 妊娠相关糖蛋白(PAG)在奶牛早期妊娠诊断上的应用现状[J]. 中国畜牧兽医. 2011, 38(11): 140-143.

[5] Friedrich M, Holtz W.Establishment of an ELISA for measuring bovin pregnancy-associated glycoprotein in serum or milk and its application for early pregnancy detection[J]. Repod Domest Anim, 2010,45(1): 142-146.

S818.9

A

1007-1733(2017)10-0012-02

北京农业职业学院技术研发与示范推广基金项目(XY-YF-16-09）

2017–05–25）