混菌固态发酵麸皮生产微生态蛋白饲料工艺研究

李翔宇+马慧+焦冠儒+杨宏黎

摘要：以麸皮为原料，以枯草芽孢杆菌和康氏木霉为菌种，以粗蛋白含量为指标，采用正交试验的方法，研究单菌和混菌固体发酵生产微生态蛋白饲料的条件。结果表明，混菌发酵的最佳工艺条件为：发酵温度32 ℃，含水量20%，接种比例（康氏木霉：枯草芽孢杆菌）1‥3，发酵时间72 h。

关键词：麸皮；正交试验；工艺；粗蛋白

中图分类号：S816.31 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2017）07-0048-04

我国是小麦种植大国，在小麦的加工中，麸皮的产量约占小麦加工量的20%。现代制粉工艺多采用脱麦胚处理以获得比较纯净的小麦麸皮。麸皮的主要成分是粗纤维，经固态发酵后，营养价值显著提高，发酵产物无不良气味且略带醇香，同时，粗蛋白和粗纤维含量亦可达到蛋白饲料的标准，是一种新型的发酵蛋白饲料，具有一定的应用价值。以枯草芽孢杆菌和康氏木霉为菌种，以粗蛋白含量为指标，研究单菌和混菌固体发酵对蛋白饲料质量的影响，旨在探讨麸皮生产微生态蛋白饲料的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 菌种

康氏木霉和枯草芽孢杆菌，购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.2 培养基

1.2.1 PDA培养基 马铃薯洗净去皮，称取200 g切成大小适中的方块，煮20～30 min（筷子一戳即入即可）。然后，取八层纱布过滤、加热，加葡萄糖20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g，以及适量的琼脂粉、维生素B1。继续加热并搅拌混匀，稍冷却后补足水分至

1 000 mL，分装，于121 ℃灭菌30 min，置于37 ℃恒温箱中培养24 h，确定无菌生长后方可使用。

1.2.2 固体培养基 称取麸皮适量，加入适量温水和其他微量元素，搅拌混匀，分装入500 mL锥形瓶，用棉塞塞紧瓶口，于121 ℃灭菌30 min，冷却，备用。

1.3 试验方法

在60 g麸皮中加适量水，添加葡萄糖和适量有机元素，灭菌，制得发酵培养基。此后接入在PDA培养基中培养48 h的菌种，在一定条件下培养一定时间后，于60 ℃低温烘干，测定其成分变化。发酵工艺路线如图1所示。

1.3.1 单菌发酵试验 进行单菌发酵试验，改变发酵温度、含水量、接种量及发酵时间等条件，测定发酵物粗蛋白质变化情况，确定最佳条件。

1.3.2 混菌发酵试验 由两种菌种（康氏木霉和枯草芽孢杆菌）进行混菌发酵，改变菌种比例、培养基含水量、发酵温度及发酵时间等条件，测定粗蛋白质含量，确定最佳试验条件。

1.4 测定方法

采用凯氏定氮法测定样品中的蛋白质含量。

1.5 正交试验设计

正交试验的水平及因素见表1。

2 结果与分析

2.1 单菌发酵

2.1.1 发酵温度对蛋白质含量的影响 发酵温度对微生物存活与生长具有重要作用。温度升高会使微生物细胞的生长速率加快，但蛋白质和核酸对温度极其敏感，高温会使蛋白质变性，降低微生物繁殖速度；过低温度会抑制酶活性，降低蛋白质合成速率，因此，适宜的温度对发酵过程具有重要意义。在15%接种量、培养时间48 h、加水量30%、pH值自然的条件下，改变培养温度（28，30，32，34，36 ℃），考察温度对粗蛋白含量的影响，结果如图2所示。

试验结果表明：分别以康氏木霉、枯草芽孢杆菌为菌种单菌发酵，发酵产物中的蛋白质含量随发酵温度升高而升高；温度继续提高，发酵产物中的蛋白质含量有下降趋势。结合实际情况，确定康氏木霉的最佳发酵温度为32 ℃、枯草芽孢杆菌的最佳发酵温度为30 ℃。

2.1.2 加水量对蛋白质含量的影响 加水量是发酵的关键因素之一。在发酵过程中，如果含水量过低，则菌体无法正常生长发育；而加水过多，则会造成传质和传氧困难，增加生产成本。在15%接种量、培养48 h、培养温度固定（康氏木霉32 ℃；枯草芽孢杆菌30 ℃）、pH值自然的条件下，改变含水量（20%，40%，60%，80%及100%），將产物在60 ℃下烘干至恒质量，测定其粗蛋白含量，结果见图3。

由图3可看出：随着水分的增加，发酵产物中的粗蛋白含量逐步增加；加水量为40%时，蛋白质含量达最大值（康氏木霉为15.76%，枯草芽孢杆菌为14.93%）；但当水分含量增加至60%时，蛋白质含量反而有所下降，且发酵物稍有霉味。这可能是由于水分含量高造成发酵物粘度过大，从而致使发酵物通透性差。发酵温度上升过高不利于菌体生长，致使发酵产物中粗蛋白含量明显下降。

2.1.3 接种量对蛋白质含量的影响 接种量可根据菌种繁殖速度确定。接入的菌种量较大，可以缩短菌丝繁殖的峰值时间，使产物的合成期提前，但会造成菌丝生长过快及培养基黏度增大，使溶解氧含量偏低，细胞衰老加快，影响发酵后劲，进而影响产物合成。接种量过少，会延长发酵周期，增加杂菌污染机会。

在培养时间48 h、培养温度固定（康氏木霉32 ℃；枯草芽孢杆菌30 ℃）、加水量20%、pH值自然的条件下，改变接种量（0，5%，10%，15%，20%，25%，30%），将产物在60 ℃下烘干至恒质量，分析测定粗蛋白含量，结果见图4。

由图4可以看出，康氏木霉菌及枯草芽孢杆菌的接种量从5%增至15%，以及由15%增至20%，粗蛋白的含量均有显著增加；由20%增至25%时，粗蛋白含量没有明显变化。因此，康氏木霉及枯草芽孢杆菌的最佳培养基接种量均为20%。

2.1.4 发酵时间对蛋白质含量的影响 在发酵过程中，发酵终点对蛋白含量提高具有重要意义。一般来说，发酵初期，粗蛋白含量随发酵时间延长而提高；到产品稳定期，粗蛋白含量基本保持恒定，此时应停止发酵；进入衰退期后，由于微生物自溶，产品的粗蛋白含量会逐渐降低，可能造成杂菌污染，影响产品品质，且增加生产成本。因此，在实际生产中，发酵时间应根据实际情况确定。endprint

在接種量20%、培养温度固定（康氏木霉32 ℃，枯草芽孢杆菌30 ℃）、pH值自然、含水量30%的条件下，改变培养时间（24，48，72，96 h），将产物在60 ℃下烘干至恒质量，分析测定粗蛋白含量，结果见图5。

由图5可以看出：从发酵起至72 h，随着发酵时间的延长，2种菌种发酵产物中的粗蛋白含量均持续显著增加；当发酵时间超过72 h后，粗蛋白含量无明显提高。考虑生产成本和经济效益，确定发酵时间为72 h。

2.2 混菌发酵正交试验结果

选择发酵温度、含水量、接种比例（康氏木霉和枯草芽孢杆菌）和发酵时间4个因素为自变量，设计四因素三水平正交试验，详见表2。

从表2直观分析可以看出：极值R的大小顺序为RD>RA>RB>RC，即各因素对粗蛋白含量影响顺序：发酵时间>发酵温度>含水量>接种比例；最佳组合D3A2B2C3，即发酵时间72 h，发酵温度32 ℃，含水量20%，接种比例3‥1。

3 结论与讨论

试验结果表明：1） 在接种量20%、加水量40%、（康氏木霉32 ℃，枯草芽孢杆菌30 ℃）培养72 h的条件下，单菌发酵的粗蛋白质含量达峰值；2） 从实验室保存的霉菌中筛选出一株产纤维素酶活力较高的康氏木霉，将其与枯草芽孢杆菌进行混菌发酵，通过优化混菌固态发酵麸皮工艺，确定最佳发酵条件为：发酵时间72 h，发酵温度32 ℃，含水量20%，接种比例3‥1；3） 固态发酵的麸皮己经达到蛋白饲料的产品标准。

在枯草芽孢杆菌和康氏木霉混合发酵试验中，若康氏木霉的比例较高，产物中的粗蛋白含量高于单菌发酵；若枯草芽孢杆菌的比例较高，产物中的粗蛋白含量较单菌发酵低，抑制康氏木霉生长。枯草芽孢杆菌作为一种重要益生菌，有改善畜禽内环境的重要作用，所以在发酵后期作为混合菌株加入，不仅可产生足够的益生菌，还能避免菌种间的相互抑制作用。

发酵过程中，发酵时间、温度对发酵有显著影响，其中发酵时间是首要因素。在试验中，发酵24 h的固体培养基外观上没有太大变化，但蛋白酶活力较高；发酵48 h后，固体培养基发生明显变化，康氏木霉固体培养基为绿色；当发酵进行72 h时，固体发酵培养基由开始的松软变得板结、坚硬，康氏木霉固体培养基颜色变化不大，粗蛋白含量基本达到峰值，但随着时间推移，粗蛋白含量变化不明显甚至降低。因为随着发酵时间的延长，固体发酵基质在不断被消耗。

参考文献

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[4] 闫华娟，刘金福，王晓闻，等.小麦麸皮酶解液对低盐固态发酵酱油品质的影响[J].食品与工业发酵，2014（40）：85-88.

Abstract： In this paper， the wheat bran used as raw material， bacillus subtilis and trichoderma koningii as culture and the crude protein content as the index， and the orthogonal experimental method was used to study the conditions for producing solid fermenting microbial protein feed bysingle bacterium and mixed bacteria solid. The optimum conditions of mixed fermentation： 32 ℃ of fermentation temperature， 20% of water content， 1‥3 of inoculation ratio （trichoderma koningi： bacillus subtilis） and 72 h of fermentation time.

Key words： bran； orthogonal experiment； technology； crude proteinendprint