响应面法优化鸭蛋清肽酶解条件及蛋清肽功能活性研究

王君虹，王 伟，张 玉，朱作艺，李 雪，叶兴乾

(1.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310023； 2.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021)

响应面法优化鸭蛋清肽酶解条件及蛋清肽功能活性研究

王君虹1,2，王 伟2，张 玉2，朱作艺2，李 雪2，叶兴乾1*

(1.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310023； 2.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021)

用响应面分析法对鸭蛋清肽酶解工艺进行优化。在单因素试验基础上，选择酶解温度、加酶量、酶解时间为自变量，鸭蛋清抗超氧阴离子能力为响应值。利用中心组合3因素3水平的试验设计，作响应面分析。试验结果表明，曲面回归方程拟合性好，制备鸭蛋清肽的最佳酶解条件为酶解温度48.5 ℃，加酶量2.85%，酶解时间4.33 h。所得鸭蛋清肽的总抗氧化能力3.24 U·mL-1，抑制羟自由基能力51.76 U·mL-1，抗超氧阴离子能力110.3 U·L-1，DPPH自由基清除率17.49%，a-葡萄糖苷酶抑制活性52.73%。

鸭蛋清； 抗超氧阴离子； 响应面分析法； 酶解工艺

蛋清蛋白有很高的营养价值，含有人体所需的全部8种必需氨基酸。蛋清蛋白同时具有重要的功能性质，如凝胶性、乳化性、起泡性等[1]。蛋清的功能性质与食品体系中的蛋白质浓度、pH、离子强度、加热时间与温度、与其他原料成分相互作用等因素密切相关[2]。蛋清蛋白被蛋白酶水解后，蛋清蛋白分子量会降低，功能性质也会得到改善，更易于消化，蛋白质的致敏性降低，并且水解物还具有抗胆固醇、抗高血压等生物活性，这些优点使得蛋清水解物研究得到人们的重视[1-2]。金嫘等[3]研究了鸡蛋清酶解的工艺条件，张英君[4]研究了酶解产物的功能性质，刘静波等[5]研究了寡肽酶解产物的制备方法。

鸡蛋的蛋白质酶解产品有降低血压、抗氧化、抗菌、促进矿物质吸收和免疫调节等功能[6-10]。鸡蛋蛋白制备活性肽的研究报道比较多，相关活性肽的功能及应用也有广泛研究。但是作为禽蛋的重要组成部分之一，鸭蛋在我国禽蛋产量占比非常重要，我国年产鸭蛋300万t左右，人均约25 kg。鸭蛋价格高出鸡蛋20%左右。鸭蛋年出口量为5万t左右，年产量和出口量都居世界首位。在鸭蛋综合利用研究中，主要以咸鸭蛋、松花蛋、皮蛋、糟蛋等为主，对于鸭蛋清的高附加值应用研究报道较少见。本研究以优化鸭蛋清制备鸭蛋清肽的酶解条件为目标，分析所得鸭蛋清肽的多种生物活性，为鸭蛋清高效应用提供技术基础。

1 材料与方法

1.1供试材料

鸭蛋由浙江田歌实业股份有限公司提供；木瓜蛋白酶(≥800 U·mg-1)，上海源叶生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶(小鼠肠粉)、对硝基苯基α-D-葡萄糖苷(PNPG)，美国Sigma公司；总抗氧化能力(T-AOC)测定、羟自由基测定和抗超氧阴离子自由基测定试剂盒，购自南京建成生物科技公司。其他试剂均为分析纯。

BS110S型分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司；H-1650型高速离心机，长沙湘仪离心机有限公司；210 Plus型紫外分光光度计，德国耶拿(Analytik Jena)公司；EZ-2溶剂蒸发工作站，英国GeneVac公司；MTYK-MI805 pH计，北京中慧天诚科技有限公司；HZQ-B恒温培养摇床、HH-4单数显单列四孔水浴锅，金坛市盛蓝仪器制造有限公司。

1.2测试方法

1.2.1 抗氧化活性测定

包括总抗氧化能力(T-AOC)测定、羟自由基测定和抗超氧阴离子自由基测定试剂盒(仅用于实验室、科研)，购自南京建成生物科技公司。测试方法参考试剂盒说明书。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

测定方法参照文献[11]。

1.2.3 鸭蛋清酶解单因素影响研究

分别考察酶解温度(35、45、55和65 ℃)、加酶量(1%、2%、3%和4%)和酶解时间(3、4、5和6 h)对所得鸭蛋清肽的抗超氧阴离子能力的影响。

1.2.4 响应面分析试验设计

根据中心组合试验设计原理，采用DESIGN EXPERT 8.0软件进行3因素3水平的响应面试验设计，优化鸭蛋清的酶解条件。以鸭蛋清抗超氧阴离子能力作为响应值，根据单因素试验结果，选择酶解温度(A)、加酶量(B)、酶解时间(C)作响应面优化的待优化因子，试验因子水平分别以-1.68、-1、0、1、1.68进行编码，对应的各因素水平分别为：A，28.2、35、45、55、61.8 ℃；B，1.32%、2.00%、3.00%、4.00%、4.68%；C，2.32、3.00、4.00、5.00、5.68 h。

2 结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1 酶解温度的影响

精确称量50 g鸭蛋清，加入2%木瓜蛋白酶，酶解时间5 h，酶解产物经超滤膜截留(MW≤3 000 U)的条件下，考察酶解温度对鸭蛋清肽抗超氧阴离子能力的影响，结果如图1所示。随着酶解温度的增加，鸭蛋清肽的抗超氧阴离子能力呈先上升后下降的趋势，酶解温度为45 ℃时，鸭蛋清肽抗超氧阴离子能力最高为96.07 U·L-1。由于酶解鸭蛋清蛋白的木瓜蛋白酶活性与温度密切相关，温度过高或者过低都会抑制木瓜蛋白酶的活性。所以选择45 ℃作为响应面中心试验点的酶解温度。

图1 酶解温度对鸭蛋清肽抗超氧阴离子能力的影响

2.1.2 加酶量的影响

精确称量50 g鸭蛋清，在酶解温度为45 ℃，酶解时间5 h，酶解产物经超滤膜截留(MW≤3 000 U)的条件下，考察加木瓜蛋白酶量对鸭蛋清肽抗超氧阴离子能力的影响，结果如图2所示。随着酶量的增加，鸭蛋清肽的抗超氧阴离子能力先是大幅度上升随后趋于平缓，当加酶量为2%时，鸭蛋清肽的抗超氧阴离子能力达到最大值为98.35 U·L-1。由于酶解鸭蛋清是酶促反应，酶浓度对酶促反应的影响从米门公式和酶浓度与酶促反应速度的关系可以说明，酶促反应速度与酶分子的浓度成正比，当底物浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度也越快。但本试验中，底物浓度是固定的，所以随着加酶量的增加鸭蛋清蛋白的水解度趋于固定，所得活性肽的量不会因为加酶量的增加而增加，所以其抗超氧阴离子能力会趋于平缓。因此，选择2%作为响应面中心试验点的加酶量。

图2 加酶量对鸭蛋清肽抗超氧阴离子能力的影响

2.1.3 酶解时间的影响

精确称量50 g鸭蛋清，在酶解温度为45 ℃，加酶量2%，酶解产物经超滤膜截留(MW≤3 000 u)的条件下，考察酶解时间对鸭蛋清肽抗超氧阴离子能力的影响，结果如图3所示。随着酶解时间的增加，鸭蛋清肽的抗超氧阴离子能力先上升后下降，酶解4 h时，鸭蛋清的抗超氧阴离子能力达到最大值为88.35 U·L-1。因此，选择4 h作为响应面中心试验点的酶解时间。

图3 酶解时间对鸭蛋清肽抗超氧阴离子能力的影响

2.2响应面分析及试验

综合单因素试验结果，采用酶解温度，加酶量和酶解时间3因素3水平设计中心组合试验。以A、B、C为自变量，以鸭蛋清肽的抗超氧阴离子能力Y为响应值，试验因素水平设计及结果见表1。应用DESIGN EXPERT 8.0软件对表1试验数据进行多元回归拟合，得到以鸭蛋清肽抗超氧阴离子能力为响应值的拟合方程：Y=108.59+1.46A+4.42B+1.67C+1.49A2-4.97B2-3.58C2+1.11AB+1.21AC-2.68BC，R2=0.932 4。

方差分析可知，加酶量(P=0.021 3*)、加酶量二次项(P=0.010 3*)和酶解时间二次项(P=0.047 0*)达到显著水平。F值为3.04，说明模型是适合的。P>F且低于0.050 0，表明模型拟合良好。各因素对鸭蛋清肽酶解影响的大小顺序B>C(P=0.328 5)>A(P=0.387 9)。整体模型达到显著水平(P=0.049 0*)。分析得最佳提取条件为：酶解温度48.5 ℃，加酶量2.85%，酶解时间4.33 h。

表1 响应面分析方案及试验结果

由因素交互作用分析结果(图4) 可见，2个因素交互会影响鸭蛋清酶解肽的抗超氧阴离子能力。拟合所得响应面能比较直观地反应各因素间的交互作用对响应值的影响。该模型在各因子交互最佳条件下的预测活性最高值为114.04 U·L-1。

图4 各因素交互影响蛋清肽抗氧化活性的响应面

2.3验证与多功能活性分析

根据公式计算所得到的鸭蛋清最佳酶解条件为酶解温度48.5 ℃，加酶量2.85%，酶解时间4.33 h。考虑到实际可操作性，选用酶解温度48.5 ℃，加酶量2.8%、酶解时间4.3 h，作为最佳工艺。在此条件下进行3次平行试验，结果表明，抗超氧阴离子能力平均值为110.3 U·L-1，结果值是预测值的96.7%，说明实验结果与模型符合良好，并达到响应值最大的目标。此时鸭蛋清肽的总抗氧化能力为3.24 U·mL-1，抑制羟自由基能力为51.76 U·mL-1，DPPH自由基清除率为17.49%，a-葡萄糖苷酶抑制活性为52.73%。

3 小结

本研究通过响应面分析法优化鸭蛋清酶解工艺条件，得到的最佳条件为：酶解温度48.5℃、加酶量2.8%、酶解时间4.3h。通过最优酶解条件试验验证，所优化的工艺参数准确可靠、稳定。所得鸭蛋清肽的抗总氧化能力3.24U·mL-1，抑制羟自由基能力51.76U·mL-1，抗超氧阴离子能力110.3U·L-1，DPPH自由基清除率17.49%，a-葡萄糖苷酶抑制活性52.73%。可知鸭蛋清肽具有较强的抗氧化活性和a-葡萄糖苷酶抑制活性，可以作为抗氧化调节亚健康食品和降血糖功能产品的优选原料。

[1] 杨万根. 蛋清蛋白水解物的制备、结构及其生物活性的研究[D]. 无锡: 江南大学,2008.

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[3] 金嫘, 王晶, 李新华. Alcalase 碱性蛋白酶酶解蛋清制备抗氧化活性肽[J]. 食品研究与开发,2009,30(6):59-62.

[4] 张英君. Flavourzyme 风味酶水解鸭蛋蛋清研究[J]. 南阳师范学院学报,2005,4(12):63-65.

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[11] 张玉, 王伟, 张一帆, 等. 响应面法优化蚕蛹蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽酶解条件[J]. 中国食品学报,2016,16(4):137-144.

收入日期：2017-07-29

浙江省自然科学基金(LY13C200015，LY15C200010，13C200005)；国家自然科学基金(31401495)

王君虹(1981—)，女，浙江玉环人，助理研究员，研究方向为食品质量与安全，E-mail: wjh-06@163.com。

叶兴乾，E-mail: psu@zju.edu.cn。

文献著录格式：王君虹，王伟，张玉，等. 响应面法优化鸭蛋清肽酶解条件及蛋清肽功能活性研究[J].浙江农业科学，2017，58(10)：1742-1745.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171022

TS253.4

A

0528-9017(2017)10-1742-04

(责任编辑侯春晓)