GnIH对去卵巢兼予雌激素大鼠下丘脑POMC的调节作用*

魏 萌 ，司丽娜，陈 磊，杨松鹤，程露阳，乔跃兵、2△

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.沧州医学高等专科学校）

GnIH对去卵巢兼予雌激素大鼠下丘脑POMC的调节作用*

魏 萌1，司丽娜1，陈 磊1，杨松鹤1，程露阳1，乔跃兵1、2△

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.沧州医学高等专科学校）

目的:探讨侧脑室微量注射促性腺激素抑制激素（GnIH）对下丘脑阿片-促黑素细胞皮质素原(POMC)蛋白表达的影响。方法：40只雌性SD大鼠建立卵巢摘除术补充雌激素（OEP）大鼠模型后随机分为对照组（n=20）和实验组（n=20），分别于侧脑室微量注射生理盐水和GnIH 4μl；每组根据注射时间不同分为注射1h、2h、4h、6四个亚组（n=5）。采用蛋白印迹技术检测下丘脑POMC蛋白表达的情况。结果：注射1h、2h、4h，实验组大鼠下丘脑POMC蛋白的表达量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。注射6h，实验组大鼠下丘脑POMC蛋白的表达量明显低于对照组（P＜0.05）。结论：侧脑室微量注射GnIH可以抑制下丘脑POMC蛋白的表达。

侧脑室；GnIH；POMC；下丘脑-垂体-性腺轴

生殖功能作为包括人类在内的诸多物种得以繁衍后代、延续种族的基础，一直受到研究者的广泛关注，而下丘脑-垂体-性腺轴是生殖功能的重要组成部分。近年的研究结果表明，促性腺激素释放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）并不是调节促性腺激素的唯一激素，早在2000年日本研究者在鸟类的下丘脑中发现了一种新的神经肽，它可以直接作用于GnRH神经元从而抑制性腺激素的合成和释放，因此被命名为促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH）[1]。阿片-促黑素细胞皮质素原（Proopiomelanocortin，POMC）是一种厌食性相关肽，裂解产物较多，其神经元广泛存在于下丘脑弓状核及邻近核团。相关研究发现，POMC神经元与GnRH神经元有突触上的联系，说明POMC可直接作用于GnRH来调节生殖功能[2]。而POMC神经元是否可以作为GnIH抑制GnRH的途径目前国内外尚无此方面的研究。本研究旨在观察大鼠侧脑室注射GnIH后下丘脑POMC蛋白表达的变化，为探讨GnIH是否可以通过POMC神经元这一途径间接影响GnRH提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立与分组 40只成年健康雌性SD大鼠（北京华阜康实验动物中心，合格证号：11401300016009）行双侧卵巢摘除术，术后第15d开始腹部皮下注射17β-雌二醇（0.1mg/kg/d）连续5d，以建立卵巢摘除术补充雌激素（OEP）大鼠模型。所有OEP模型大鼠随机分为实验组和对照组，两组再根据注射时间不同分为注射1h、2h、4h、6h四个亚组，每组5只。根据George Paxinos[3]的方法定位侧脑室：前囟点后1.0mm，旁开1.5mm，进针深度4.4mm。实验组和对照组组大鼠分别向侧脑室微量注射GnIH（PeproTech公司）和生理盐水各4μl，于5min内注射完毕。

1.2 蛋白样品制备和Western blot分析 两组大鼠分别微量注射GnIH和生理盐水1h、2h、4h、6h后处死，迅速取出下丘脑称重，加入裂解液后提取总蛋白，总蛋白含量用蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）测定，电泳时蛋白上样量120μg。经SDS-PAGE（12%分离胶，4%堆积胶）分离的蛋白电转移（150mA，1.5h）至PVDF膜（Millipore）上，含5%脱脂奶粉的TBS缓冲液室温封闭1h，一抗[兔抗POMC多克隆抗体(1：1000，Santa Cruz公司)，鼠抗β-actin单克隆抗体(1：1000，Abcam公司)]4℃孵育过夜，二抗[(HRP)结合的羊抗兔IgG(1：1000，Pierce公司)和羊抗小鼠IgG(1：1000，Pierce公司)]孵育1h，洗膜5次后，化学发光法显色。图像扫描后采用Quantity One 4.6.2分析软件分析条带的平均灰度值，以目的条带灰度值与对应β-actin条带灰度值之比作为POMC蛋白表达量的相对水平。

1.3 统计分析 各项实验至少重复3次。实验数据以均值±标准差（±s）表示，采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

注射1h、2h、4h，实验组大鼠下丘脑POMC蛋白的表达量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。注射6h，实验组大鼠下丘脑POMC蛋白的表达量明显低于对照组（P＜0.05）。见附图、附表：

附图 大鼠下丘脑POMC蛋白的表达

附表 侧脑室注射GnIH对OEP大鼠下丘脑POMC蛋白表达的影响（n=5）

3 讨论

生殖功能是各种生物繁衍生息的基础，而下丘脑-垂体-性腺轴是调控哺乳动物生殖功能的主要系统之一。GnRH是1971年发现的一种下丘脑神经肽，可以通过垂体门脉系统，刺激垂体前叶分泌促性腺激素，即黄体生成素（luteinizing hormone，LH）和卵泡雌激素（folliclestimulating hormone，FSH），二者又可以作用于性腺，促进精子和卵子的发生[3]。在过去的30年里，GnRH被认为是下丘脑唯一的调节激素。直到研究者于2000年在鸟类的下丘脑内发现了一种新的神经肽，它可以通过抑制促性腺激素的合成和释放来影响鸟类的生殖功能，因此被命名为GnIH[1]。GnIH最早被发现于鸟类的下丘脑，可以抑制促性腺激素的合成和释放[4]。而近年的研究结果证明，在哺乳动物下丘脑的背内侧核及背内侧核与下丘脑腹内侧核中间的区域也发现了GnIH神经元[5-7]。2012年，研究者在GnRH神经元上发现了GnIH受体的表达，说明GnIH可以直接作用于GnRH来完成对生殖功能的抑制作用[7]。POMC是一种厌食性相关肽[8]，其神经元主要表达在下丘脑的弓状核及相近核团。POMC裂解后的β内啡肽可调节机体的生殖功能。相关的研究证明，POMC神经元可直接作用于GnRH神经元，进而促进生殖功能[2]。而GnIH是否可以通过POMC这一途径来调控GnRH神经元进而调节促性腺激素的合成和释放，国内外尚无相关报道。

本研究建立了OEP大鼠模型，消除雌激素对GnRH的影响，采用蛋白印迹技术观察了大鼠侧脑室微量注射GnIH 1h、2h、4h、6h后，下丘脑POMC蛋白表达的变化情况。结果显示，侧脑室微量注射GnIH 1h、2h、4h后，下丘脑POMC蛋白表达与对照组相比无明显变化；而侧脑室注射GnIH 6h后，下丘脑POMC蛋白的表达与对照组相比明显降低，说明侧脑室注射GnIH在一定时间内可抑制下丘脑POMC蛋白的表达。

本研究表明，侧脑室注射GnIH可抑制大鼠下丘脑POMC蛋白的表达，同时提示GnIH除了直接作用于GnRH神经元外，还可能通过POMC这一途径间接影响GnRH，确切机制尚需进一步研究。

[1]Tsutsui K, Saigoh E, Ukena K, et al. A novel avian hypothalamic peptide inhibiting gonadotropin release[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 275(2): 661-667.

[2]Chen WP, Witkin JW, Silverman AJ. beta-Endorphin and gonadotropin-releasing hormone synaptic input to gonadotropin-releasing hormone neurosecretory cells in the male rat[J]. J Comp Neurol, 1989, 286(1): 85-95.

[3]Cunningham MJ, Clifton DK, Steiner RA. Leptin’s actions on the reproductive axis: perspectives and mechanisms[J]. Biol Reprod,1999, 60(2): 216–222.

[4]Bentley GE, Per fi to N, Ukena K, et al. Gonadotropin-inhibitory peptide in song sparrows (Melospiza melodia) in di ff erent reproductive conditions, and in house sparrows (Passer domesticus) relative to chicken-gonadotropin-releasing hormone[J]. J Neuroendocrinol, 2003, 15(8): 794-802.

[5]Ubuka T, Inoue K, Fukuda Y, et al. Identi fi cation, expression, and physiological functions of Siberian hamster gonadotropin-inhibitory hormone[J]. Endocrinology, 2012, 153(1): 373-385.

[6]Tobari Y, Iijima N, Tsunekawa K, et al. Identification of gonadotropin-inhibitory hormone in the zebra fi nch (Taeniopygia guttata): Peptide isolation, cDNA cloning and brain distribution[J].Peptides, 2010, 31(5):816-826.

[7]Chowdhury VS, Ubuka T, Osugi T, et al. Identi fi cation, localization and expression of LPXRFamide peptides, and melatonin-dependent induction of their precursor mRNA in the newt brain[J]. J Endocrinol,2011, 209(2): 211-220.

[8]Cone RD, Lu D, Koppula S, et al. The melanocortin receptors:agonists, antagonists, and the hormonal control of pigmentation[J].Recen Prog Horm Res, 1996, 51: 287-317.

REGULATING EFFECTS OF GNIH ON POMC IN HYPOTHALAMUS OF OEP RATS

WEI Meng, SI Li-na, CHEN Lei, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To explore the e ff ects of microinjection of gonadotropin releasing hormone (GnIH) intolateral ventricle on proopiomelanocortin (POMC) expression in hypothalamus of ovariectomized and estrogen-primed(OEP) rats.Methods:40 female SD rats were established OEP rat’s model and then randomly divided into control group and experimental group with 20 rats in each group. The rats in 2 groups were injected 4μl normal saline and 4μl GnIH into the lateral ventricle respectively; and the rats in each group were further divided into 1h, 2h, 4h, 6h 4 subgroups according to the time after injection (n=5). Western blot was used to detect the POMC protein expression in hypothalamus of rats in each group.Results:1h, 2h, 4h after injection, there was no statistically signi fi cant di ff erence about POMC expression in hypothalamus of rats in experimental group compared with that of rats in control group(P＞0.05). 6h after injection, the POMC expression in hypothalamus of rats in experimental group was obviously lower than that of rats in control group (P＜0.05).Conclusions:Microinjection of GnIH into the lateral ventricle can inhibit expression of POMC in hypothalamus.

Lateral ventricle; GnIH; POMC; Hypothalamic-pituitary-gonadal axis

R338.2

A

1004-6879（2017）06-0458-03

* 河北省自然科学基金资助项目（H2013406115），河北省科技厅计划项目（08276101D-20），河北省高等学校科学研究项目（QN2015121），河北省卫生厅医学科学研究项目（20130012）

△ 通讯作者

（收稿日期：2017-01-18）

(基础医学栏目编辑：陈志宏)

（收稿日期：2017-01-18）

(基础医学栏目编辑：陈志宏)