佛香饮治疗原发性痛经作用实验研究

杨新蕊 缪希红 冯晓静 白云鹤 田 甜

(1 河北省承德市第三医院妇瘤科,承德,067000; 2 河北省承德市中心医院皮肤科,承德,067000)

佛香饮治疗原发性痛经作用实验研究

杨新蕊1缪希红2冯晓静2白云鹤1田 甜1

(1 河北省承德市第三医院妇瘤科,承德,067000; 2 河北省承德市中心医院皮肤科,承德,067000)

目的:观察佛香饮对原发性痛经的治疗作用,为其临床应用提供依据。方法:采用55 ℃和48 ℃热刺激建立小鼠疼痛模型、缩宫素法建立大鼠原发性痛经模型,观察佛香饮对痛经的镇痛作用;以痛经模型大鼠离体子宫平滑肌收缩幅度、频率为指标,评价佛香饮的镇痛作用及对子宫平滑肌活力的影响;以缩宫素致正常大鼠离体子宫平滑肌痉挛性收缩,观察佛香饮拮抗缩宫素的致痉作用;以痛经模型大鼠血清中前列腺素F2α(PGF2α)含量为指标,分析其镇痛作用机制。结果:55 ℃热板实验,佛香饮7.2 g/kg(按生药计)组小鼠痛阈低于模型组(P<0.05);48 ℃热板实验,佛香饮1.8、3.6和7.2 g/kg组痛阈均低于模型组(P<0.05或P<0.01);痛经模型大鼠扭体反应次数均低于模型对照组(P<0.05或P<0.01);佛香饮3.6和7.2 g/kg剂量组子宫平滑肌收缩频率显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),收缩幅度显著高于模型组(P<0.05或P<0.01);佛香饮可剂量依赖性的降低缩宫素引起大鼠离体子宫平滑肌收缩曲线的上升高度;各剂量组血清中PGF2α的含量显著低于模型组(P<0.05或P<0.01)。结论:佛香饮对热刺激性疼痛及原发性痛经性疼痛均有显著的镇痛及抑制子宫平滑肌痉挛性收缩的作用,抑制PGF2α的合成或释放是其治疗痛经的机制之一。

佛香饮;原发性痛经;镇痛;子宫平滑肌;前列腺素F2α

佛香饮是本课题组临床多年应用的自拟方,以妇科常用当归—川芎和川芎—香附[1]2个药对合并而成,组方为当归15 g、川芎15 g、香附9 g组成。痛经之病机多为瘀、虚、寒凝、气滞。当归,甘辛温,补血调经,活血止痛;川芎,辛温,活血行气,祛风止痛;香附长于疏肝解郁,调经止痛,理气调中,乃气病之总司,女科之主帅也。当归、川芎、香附3药合用,可用于因气滞、血瘀、血虚、寒凝等病因引起的痛经以及虚实夹杂等复杂病机之痛经。本方组方精简,多年临床应用该方治疗原发性痛经经期应用可快速缓解症状,经前3 d服用可预防经期腹痛,连续服用3～5个月经周期。按文献方法[2],以停药后第3个月痛经程度积分为疗效指标,布洛芬为阳性对照药,对本方进行临床疗效观察结果显示,佛香饮组总有效率75.6%,布洛芬组为7.78%。本研究以布洛芬为阳性对照药,观察本组方对痛经模型动物的止痛作用及其对子宫平滑肌张力的影响,为其临床用药提供实验依据,并为探讨其作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD大鼠,SPF级,雌性,未孕,体质量220～240 g,北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号:SCXK(京)2009-0004,实验前在本实验室适应5 d,实验室温度22～24 ℃,相对湿度55%～60%,光照时间12 h(7:00-19:00)。大鼠颗粒饲料,北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

1.1.2 受试药物 佛香饮水提取物的制备:当归、川芎、香附按5∶5∶4配伍,加8倍量水,浸泡8 h,煎煮2次,煎煮30 min/次,合并煎煮液,过滤,减压浓缩至1.44 g/mL(按生药计,临用时稀释为0.72,0.36 g/mL);苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸有限公司,生产批号:1001051,1 mL:1 mg);缩宫素注射液(马鞍山丰原制药有限公司,生产批号:1302151,1 mL:10U);布洛芬颗粒(哈药集团世一堂制药厂,生产批号:130206,0.2 g/包)。

1.1.3 试剂与仪器 试剂:大鼠PGF2α酶联免疫检测试剂盒(上海池泽生物科技有限公司,生产批号:201307)。L-精氨酸(L-Arg)(北京化学试剂公司,生产批号:140421);L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)(美国Sigma公司)。洛氏液(Locke′s solution)[2]：NaCl 9.0 g/L,KCl 0.42 g/L,CaCl20.24 g/L,NaHCO30.2 g/L,Glucose 1.0 g/L,临用时重蒸水新鲜配制[3]。仪器:MacLab/4e四道生理记录仪(澳大利亚生产)。

1.2 方法

1.2.1 镇痛作用 小鼠55 ℃热板实验将雌性小鼠放置到预热到55 ℃的恒温热板仪上,以舔后足为痛反应,以出现舔后足的潜伏期作为痛阈值,以药前2次痛阈的均数作为基础痛阈,选取药前基础痛阈合格(痛阈大于5 s,小于30 s)的小鼠60只,随机分为佛香饮方饮1.8、3.6、7.2 g/kg剂量组(按生药计算,分别相当于人等效剂量的1/2倍、等倍及2倍),布洛芬颗粒0.08 g/kg(相当于人等效剂量2倍)对照组及模型组。灌胃给药,给药体积为0.2 mL/10 g体重,空白对照组灌胃等体积蒸馏水;注射给药后30、45、60、120 min测定药后痛阈。并按文献方法[4]计算痛阈提高百分率。

小鼠48 ℃热板实验 雌性小鼠置于预热到48 ℃的恒温热板仪上,以舔后足为痛反应,以出现舔后足的潜伏期作为痛阈值,以药前2次痛阈的均数作为基础痛阈,选取药前基础痛阈合格(痛阈大于5 s,小于30 s)的小鼠60只,随机分组,分组方法、给药剂量和途径均与1.5.1.1相同。灌胃给药后30、45、60、120 min测定药后痛阈值,计算痛阈提高百分率[4]。

1.2.2 对缩宫素诱发痛经模型大鼠痛反应的影响 雌性SD大鼠60只,随机分为正常对照组、佛香饮1.8,3.6和7.2 g/kg组,除正常对照组外,其他组大鼠均每天皮下注射己烯雌酚2 mg/kg,连续10 d。皮下注射己烯雌酚第6日开始,各组灌胃给予相应的药物,给药容积为5 mL/kg,模型组注射同体积蒸馏水,连续5 d。末次给药后1 h，腹腔注射缩宫素20 U/kg。立即记录大鼠出现痛反应(扭体反应)的潜伏期、30 min内扭体次数,计算扭体次数的抑制率。扭体次数抑制率=(模型组扭体次数-给药组扭体次数)/模型组扭体次数×100%[5]。大鼠血清中PGF2α含量测定 上述大鼠,注射缩宫素后30 min,乙醚麻醉,腹腔静脉取血,低温离心机于4 ℃、3 000 r/min，离心15 min,取血清,冰箱-20 ℃保存备用。按试剂盒方法测定各组大鼠血清中PGF2α的含量。

1.2.3 对原发性痛经模型大鼠离体子宫平滑肌活力的影响 上述模型动物取血后,迅速取出大鼠子宫,置于冷洛氏液中清洗,取每侧子宫角中段2 cm,固定于盛有10 mL洛氏液的恒温浴槽中,与MecLab/4e相连的张力换能器上。浴槽内营养液温度为37.5～38 ℃,恒量通入95% O2+5% CO2混合气体。调节微调器加前负荷1 g,平衡40 min,待子宫恢复自发节律,收缩频率和幅度稳定后,记录各组动物子宫的收缩频率和幅度[6]。

1.2.4 对缩宫素引起正常大鼠离体子宫平滑肌收缩力的影响[3-4]雌性未孕成年大鼠20只,皮下注射己烯雌酚2 mg/kg,连续3 d。第4天处死大鼠,快速剖取子宫,其他操作程序同2.2将离体子宫分为空白对照组,缩宫素对照组及不同浓度佛香饮组。待子宫收缩节律、幅度、基线平稳后,正常对照组加入0.2 mL的洛氏液,缩宫素对照组加入0.2 mL的洛氏液,孵育5 min,加入2.5 U/mL的缩宫素0.2 mL(终浓度为0.05 U/mL)。记录子宫平滑肌最大收缩力(基线上升的高度)。给药组分别预先加入浓度为10 mg/mL,20 mg/mL及40 mg/mL(按生药计算)的佛香饮0.2 mL,离体器官浴槽内药物终浓度分别为1 mg/mL,2 mg/mL及4 mg/mL,加药后孵育5 min,加入0.2 mL缩宫素,记录子宫平滑肌基线最大上升高度,并计算抑制率,抑制率%=(缩宫素组基线平均上升高度-给药组基线平均上升高度)/缩宫素组基线平均上升高度×100%。

表1 佛香饮对(55 ℃热板实验)小鼠痛阈值的影响

注:与空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与用药前比较:△P<0.05,△△P<0.01;与布洛芬组比较▲P<0.05

表2 佛香饮对48 ℃热板实验)小鼠痛阈值的影响

注:与空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与用药前比较:△P<0.05,△△P<0.01

2 结果

2.1 对(55 ℃热板实验)小鼠痛阈值的影响 7.2 g/kg佛香饮组的痛阈显著高于给药前或空白对照组比较(P<0.05),1.8 g/kg和3.6 g/kg组痛阈与药前或空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。布洛芬组痛阈与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。药后45、60和120 min佛香饮7.2 g/kg组痛阈高于布洛芬组,差异有统计学意义(P<0.05),结果见表1。

2.2 对(48 ℃热板实验)小鼠痛阈值的影响 佛香饮各剂量组小鼠药后痛阈值均高于药前或空白对照组(P<0.05或P<0.01),布洛芬与佛香饮3.6和7.2 g/kg剂量组小鼠痛阈比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 对大鼠扭反应体潜伏期和扭体反应次数的影响 佛香饮各剂量组痛反应潜伏期均长于模型对照组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);各剂量组大鼠的扭体反应次数均低于模型组,其中3.6和7.2 g/kg剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01),1.8 g/kg组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。布洛芬颗粒组大鼠扭体反应潜伏期明显长于模型组(P<0.01)。扭体反应次数显著低于模型组(P<0.01);布洛芬与佛香饮3.6和7.2 g/kg剂量组比较痛反应潜伏期和扭体反应次数差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 佛香饮对痛经模型大鼠痛反应的影响

注:与模型组比较:*P<0.05;**P<0.01

2.4 对大鼠血清中PGF2α含量的影响 MC组大鼠血清中PGF2α的含量显著高于NC组(P<0.01),佛香饮3个剂量组动物血清中PGF2α的水平显著低于MC组(P<0.05或P<0.01),结果见表2。

表4 佛香饮对原发性痛经模型大鼠血清中 PGF2α含量的影响

注:与模型组比较*P<0.05,**P<0.01

2.5 对原发性痛经模型大鼠离体子宫平滑肌活动力的影响 MC大鼠离体子宫平滑肌的收缩频率显著高于NC组、收缩幅度低于NC组(P<0.05),说明模型组子宫平滑肌张力增高,舒张不完全。佛香饮各剂量组离体子宫收缩频率明显低于MC组(P<0.05或P<0.01),收缩幅度高于模型组(P<0.05),说明佛香饮可有效的抑制缩宫素引起的子宫平滑肌痉挛性收缩作用。见表5。

表5 佛香饮对原发性痛经模型大鼠离体子宫收缩频率和幅度的影响

注：与模型组比较*P<0.05,**P<0.01

2.6 对缩宫素诱发正常大鼠子宫平滑肌痉挛性收缩的影响 终浓度为1 mg/mL,2 mg/mL及4 mg/mL的佛香饮孵育组,子宫收缩基线上升的幅度显著低于缩宫素组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),说明佛香饮可拮抗缩宫素诱发的正常未孕大鼠子宫平滑肌的痉挛性收缩。见表6。

表6 佛香饮对缩宫素诱发子宫平滑肌痉挛性收缩作用的影响

注：与缩宫素组比较*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

3.1 依据传统医学理论分析佛香饮组方的可行性 原发性痛经属于中医学“经行腹痛”的范畴,始载于张仲景《金匮要略·妇人杂病脉证并治》:带下,经水不利,少腹满痛[7]。痛经的主要病因为女性在月经期或月经前后,血海由充盈逐渐转为泄溢,出现急而大的气血变化。如在此时出现大的情绪波动,或病邪乘虚侵入,均可诱使冲任失调、血瘀阻滞,寒凝经脉,终至胞宫经血不畅,不通而痛,或不荣而痛[8]。以传统中药学理论分析,当归甘辛温,补血调经,活血止痛之功效,既能补血,又能活血,补中有动,行中有补,既可通经,又能活络。凡妇女月经不调,痛经,血虚闭经,均可用之。川芎辛温,具活血祛瘀、行气止痛之功效,为“血中气药”,用于血瘀气滞的月经不调、痛经、经闭,与当归相须为用,以增强活血、行瘀、止痛之效。香附疏肝解郁,调经止痛,理气调中,乃气病之总司,女科之主帅也,可用于肝郁气滞,月经不调,经闭痛经等[9]。当归和川芎为临床常用补血活血之对药,配以香附3药合用,对于因气滞、血瘀、血虚、寒凝等病因引起的痛经以及虚实夹杂等复杂病因之痛经均可获良效。

3.2 依据现代医药学理论分析佛香饮组方的可行性 现代医学认为原发性痛经发病机制非常复杂,包括神经,精神,内分泌,饮食,营养等多方面改变,导致PGs、OT、E2等多种递质水平异常,致子宫平滑肌张力增高,挤压肌间血管,减少子宫肌层血氧供应量,造成局部酸性代谢产物聚积,引起疼痛。中医学与现代医学对原发性痛经的发病机制的认识是相通的。现代药理学研究证明,当归-川芎(佛手散)为妇科常用药对,对小鼠离体子宫平滑的张力有明显的抑制作用[10-11]。当归挥发油对大鼠、小鼠等多种动物不同生殖生理阶段,如未孕、妊娠早期、晚期及产后的子宫平滑肌活力均有抑制作用。并可拮抗组胺、乙酰胆碱、缩宫素等诱发的子宫平滑肌痉挛性收缩[12]。当归多糖对原发性痛经有显著的镇痛作用[9]。川芎内酯及阿魏酸为缓解子宫平滑肌痉挛作用的主要成分,川芎和当归中均含阿魏酸。阿魏酸为当归和川芎的共有成分。川芎嗪有显著的镇痛、改善实验性微循环和血瘀障碍,增大毛细血管口径,改变血流流态,增快血流速度,增加血流量,增多开放毛细血管数、抑制血小板聚集等作用。香附对小鼠痛经模型有显著的镇痛作用[13]。张发初等报道,5%香附流浸膏对豚鼠、兔、猫和犬等动物的离体子宫,无论己孕或未孕,都有抑制作用,使其收缩力减弱、肌张力降低。

3.3 本研究采用不同温度的热板实验 观察了佛香饮的镇痛作用,热板法属于热刺激致痛模型,较高温度(55 ℃)热刺激建立的疼痛模型,主要用于评价具有较强镇痛作用的中枢性镇痛药的镇痛效果,较低温度(48～50 ℃)的热刺激建立的疼痛模型,主要用于评价较弱强度的外周镇痛药物的镇痛效果[14]。本实验结果显示,佛香饮对48 ℃热刺激引起的痛反应有显著的抑制作用,只有在7.2 g/kg才对55 ℃热刺激引起的痛反应有抑制作用,提示佛香饮的镇痛作用主要是外周性的,大剂量时有一定的中枢性镇痛作用。

利用缩宫素引起子宫平滑肌痉挛的性质,建立的类痛经模型,是目前较为公认的评价治疗痛经药物的模型。佛香饮对该模型有较强的镇痛作用,提示,本方具有拮抗缩宫素,缓解子宫平滑肌痉挛作用[15,16]鼠的扭体反应次数,延长痛反应潜伏期,提示佛香饮对缩宫素诱发的原发性痛经模型有显著镇痛作用。佛香饮不同剂量组大鼠离体子宫平滑肌活动频率低于模型对照组,收缩幅度高于模型对照组,提示佛香饮显著抑制痛经模型大鼠子宫平滑肌痉挛性收缩。正常大鼠离体子宫实验结果显示,终浓度为0.05 U/mL的缩宫素可使正常大鼠离体子宫平滑肌活动基线显著升高,即产生痉挛性收缩,用不同浓度的佛香饮孵育正常大鼠离体子宫平滑肌后,再加入相同剂量的缩宫素,子宫平滑肌的活动基线升高的幅度显著低于缩宫素对照组,证明佛香饮可显著抑制缩宫素引起的正常大鼠离体子宫平滑肌痉挛性收缩。由此可见,佛香饮体内外给药均可抑制缩宫素引起的子宫平滑肌痉挛性收缩,使其舒张较完全,增加子宫平滑肌的血、氧供量,降低局部酸性代谢产物含量,进而减轻痛反应。因此,推测抑制子宫平滑肌痉挛是佛香饮治疗原发性痛经作用的主要环节。

痛经患者血中PGF2α含量明显高于正常人,PGF2的浓度与痛经程度呈正相关[17]。PGF2α与子宫平滑肌内螺旋小动脉上的PGF2α受体结合,致小动脉收缩,局部血、氧供应减少、酸性代谢产物聚积,刺激痛神经纤维,引起痛经[18-20]。同时,PGF2α可显著增加人子宫平滑肌细胞中缩宫素受体的表达,增强缩宫素收缩子宫平滑肌的作用[21]。布洛芬是一种有效的经期止痛药,其作用机制通过抑制环氧化酶的活性而抑制前列腺素的合成,降低子宫组织中前列腺素的水平,降低子宫平滑肌张力,减轻子宫内压力,抑制子宫剧烈收缩[22-23]。本实验结果显示,布洛芬和佛香饮均可降低血清中PGF2α的水平,提示抑制PGF2α或释放是其治疗原发性痛经的机制之一。

综上所述,从中医学和现代药理学研究分析,当归、川芎和香附组方,均可对原发性痛经从多层次、多水平、多靶点,有针对性的对多种病因的原发性痛经达到治疗目的。本实验结果证明了佛香饮对原发性痛经有良好的治疗效果。其作用机制有待进一步研究。

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ExperimentalStudyonEffectsofFoxiangDecoctioninTreatingPrimaryDysmenorrhea

Yang Xinrui1，Miao Xihong2，Feng Xiaojing2，Bai Yunhe1，Tian Tian1

(1ObstetricsandGynecology，ThirdHospitalofChengdeCity，Chengde067000，China; 2DermatologyDepartmentofCentralHospitalofChengdeCity，Chengde067000，China)

Objective:To investigate the effects of Foxiang decoction (FXD) in treating primary dysmenorrhea for providing the basis for clinical application.MethodsThe mouse model of pain were established by using 55 ℃ and 48 ℃ thermal stimulation; and the rat model of primary dysmenorrhea was established by subcutaneous injection of oxytocin.The analgesic effect of Foxiang decoction on dysmenorrhea was observed by the two models.The contraction frequency and contraction amplitude of uterine smooth muscle were examined to evaluate the analgesic effect of FXD on primary dysmenorrhea model rats and its effects on the tension of uterus smooth muscle.As well as，it was examined that the antagonism effect of FXD on the uterine smooth of normal rats tetanic contraction induced by oxytocin.The contents of prostaglandin F2 (PGF2) in serum of rats with dysmenorrhea were determined to analyze the mechanism of its analgesic effect.ResultsIn the 55 ℃ hot plate test，the pain threshold of FXD7.2 g/kg group (dollars by crude drug) was lower than the model group (P<0.05); in the 48 ℃ hot plate test，the pain threshold of FXD 1.8，3.6 and 7.2 g/kg group were lower than the model group (P<0.05 orP<0.01); reaction times writhing dysmenorrhea rats were lower than the model group (P<0.05 orP<0.01); writhing responses number of rats in all FXD group were lower than that of model group (P<0.05 orP<0.01).In 3.6 and 7.2 g/kg of FXD dose group，the uterine smooth muscle contraction frequency was significantly lower than that of dysmenorrhea model group (P<0.05 orP<0.01)，but contraction amplitude was significantly higher than that of dysmenorrhea model group (P<0.05 orP<0.01).In uterine smooth muscle of normal rats，FXD significantly inhibited heighten of the contraction curve baseline induced by oxytocin by dose dependently.The content of PGF2 in the serum in all dose group was significantly lower than that of the MC group (P<0.05 orP<0.01).ConclusionFXD has significant analgesic effect on heat pain and primary dysmenorrhea pain，and the inhibition of uterine smooth muscle spastic contraction pain.The inhibition of the synthesis or release of PGF2α is one of the mechanisms of its treatment of dysmenorrhea.

Foxiang decoction; Primary dysmenorrhea; Analgesic; Uterine smooth muscle; PGF2α

河北省中医药管理局(2016159)

杨新蕊(1973.12—),女,学士,副主任医师,研究方向:中医治疗痛经,E-mail:1285478613@qq.com

缪希红(1974.12—),女,学士,副主任医师,研究方向:中医治疗痛经,E-mail:13643243330@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.035

(2016-11-13收稿 责任编辑：王明)